[发明专利]一种条柄铦囊蘑鉴别用分子标记及引物和探针

说明书

本发明涉及一种条柄铦囊蘑鉴别用分子标记及引物和探针，所述条柄铦囊蘑ITS特异性分子标记具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。针对所述分子标记设计特异性检测条柄铦囊蘑的基因芯片，能在短时间内对条柄铦囊蘑进行特异性鉴定，提高条柄铦囊蘑鉴别的准确性和灵敏性，具有快速、准确、成本低的特点。

技术领域

本发明属于生物鉴别技术领域，涉及一种真菌的鉴别方法，特别是涉及一种用于鉴别囊蘑菌属真菌条柄铦囊蘑的ITS特异性分子标记，以及用于所述鉴别方法的专用引物、探针和基因芯片。

背景技术

管涔山地处吕梁山系北端，平均海波1800～2000m，是温带大陆性季风气候和西伯利亚冬季冷气团交融门户，降雨量充沛，是山西三大河流的发源地，植物覆盖率高，植被分布呈现明显的垂直带谱。特殊的地理环境和气候环境造就了该地区独特的生物多样性，而来自管涔山脉的食用菌也因其独特的风味和营养价值，曾被纳为皇室贡品。因此，开展管涔山系食用菌分子标记研究，对于这一地区特有品种的开发与保护具有重要意义。

条柄铦囊蘑，Melanoleuca gramrnnopodia，属于担子菌纲、伞菌目、白蘑科、囊蘑菌属，分布于黑龙江、西藏、山西等地，是一种生长在管涔山一带的著名野生食用菌。条柄铦囊蘑的子实体小，菌盖直径2～3cm，色较深，气味温和，夏秋季长于林中空地或林缘草地，常常群生，少见单生。

传统的食用菌分类鉴定主要依据子实体的形态学特征，包括担孢子的大小和子实体真皮菌丝的形态特征。但子实体的许多形态学特征往往随生长条件的不同而发生变化，同时许多鉴别性特征又经常是几个种所共有，这就给传统的分类学带来了很大困难，仅仅依据形态学特征进行菌种鉴定不是十分可靠。

随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的食用菌鉴定技术提供了有效手段。基因芯片是一种新型的DNA识别技术，利用芯片的高通量和特异性优势，可以在芯片上对相近亲缘关系的食用菌进行辨识，以提高检测的准确性。同时，基因芯片检测主要操作步骤依靠仪器设备完成，检测周期只需要6～8小时，不依赖传统检测中人的主观经验，可以在短时间内获得准确的检测鉴别结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种条柄铦囊蘑特异性ITS分子标记，以建立一种快速、灵敏、特异性好的条柄铦囊蘑鉴别方法。

提供用于所述条柄铦囊蘑鉴别方法的引物和核酸探针，是本发明的另一发明目的。

本发明采用基因克隆技术，并结合基因芯片技术，首先获得了条柄铦囊蘑ITS DNA片段中一段高度保守且特异性强的核酸序列，以作为特异性鉴别条柄铦囊蘑的分子标记；进而依据该分子标记设计并合成了一组特异性引物和核酸探针，建立了特异性鉴别条柄铦囊蘑的方法，并对所建立的方法进行了有效性评估试验。

为实现上述发明目的，本发明所提供的条柄铦囊蘑ITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述ITS特异性分子标记是使用通用引物ITS1/ITS4对从不同产地的条柄铦囊蘑中提取的总DNA进行PCR扩增，PCR产物进行毛细管测序，测序结果在NCBI中进行全核酸数据库比对分析，确定出的能够作为基因芯片检测靶序列的特征序列。

进而，本发明根据上述靶序列，依据引物与探针设计原则，设计了一对具有SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的、用于扩增所述ITS特异性分子标记的引物，以及一种具有SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的、用于检测所述ITS特异性分子标记的核酸探针。

更具体地，本发明是在引物1的5'端标记有荧光报告基团Hex，并将所述核酸探针进行氨基化处理，即在核酸探针的5'端连接氨基，最终人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探针。

引物1：5'Hex-CCTTGGATTTGGGGATTGGTT-3'。