[发明专利]一种检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种试剂盒，尤其涉及一种检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒及其应用。

背景技术

海豚链球菌(Streptococcus iniae)病是一种重要的鱼类细菌病，常在罗非鱼、鲈鱼等养殖鱼类中引起爆发性鱼病，导致鱼群大量死亡。再者，海豚链球菌还可以通过伤口感染人，已被确立为新型人畜共患病原。

目前，国内检测海豚链球菌仍然采用传统的形态学、染色和生化试验进行鉴定，花费时间长，而且灵敏度和特异性都难以满足快速检测和生产上的需要。国际水生动物疾病诊断参考实验室认为，同已有的细菌生化鉴定和免疫学检测方法相比，PCR技术能够解决大多数有关敏感性和特异性的问题，而与普通PCR相比，荧光PCR检测方法的结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染，其在水产疾病诊断领域具有着更加广阔的应用前景。

核糖体是细菌唯一的细胞器，是蛋白质合成的场所，它的沉降系数是70S，在适当条件下解离成50S和30S两个大小亚基，两个亚基都含有RNA和蛋白质。rRNA按沉降系数分3种，分别为5S，16S和23S。5S和23SrRNA基因在50S亚基中，16S rRNA在30S亚基中，它们是核糖体不可缺少的成分。16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16SrRNA基因约由1540个核苷酸组成，并含有多个拷贝(即转录单位)，如大肠杆菌K12染色体基因组中，含7个16SrRNA拷贝，而在一般情况下，细菌的其他结构基因都是单拷贝的。细菌16SrRNA基因序列由保守区和可变区组成，两者互相交错排列。编码rRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。现有细菌的RNA均由其祖先一代一代传下来，虽然在长期的进化过程中，由于不时突变而有较大变化，但其祖先的某些痕迹仍留在其核苷酸序列中，这种痕迹为细菌的系统进化研究提供了可能。因此，有人将rRNA称为细菌的“化石”。这一“化石”的存在，为细菌的研究提供了方便。由于16SrRNA基因核苷酸序列总长度适宜，结构完整，更便于对细菌进行各种研究。设计一对引物，以16SrRNA为靶分子在适当条件下进行PCR扩增，便得到扩增后的16SrRNA片段，用链终止法或化学降解法对片段进行测序，序列与基因库中的片段比对，便得知未知菌与基因库中其他菌的相似性，从而完成对菌的鉴定。当鉴定同源性很高的菌种时，可以用生理生化实验或其他方法作为补充。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对性强、灵敏度高，较于类似试剂盒更加准确的荧光PCR检测试剂盒，用来在鱼类海豚链球菌病高发季节，大批量、快速、准确的鉴定该病。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒，其中，包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于检测鱼类链球菌的特异性引物和特异性探针，其中：上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

具体地，SEQ ID NO:1序列为5’-actatgagatggacctgcgtt-3’，SEQ ID NO:2序列为5’-cagtcccagtgtggccgatc-3’，SEQ ID NO:3序列为5’-caccaaggcgacgatacatagccga-3’。

所述TaqMan探针为经过荧光标记，其5'端标记有报告荧光基团，3'端标记有淬灭荧光基团。

引物设计模板SEQ ID NO:4出自NCBI数据库Y07622号。

所述报告荧光基团选自FAM、HEX、ROX、VIC中的一种，优选为ROX；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ中的一种，优选为BHQ。

本发明检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒应用在检测所有鱼类海豚链球菌，尤其检测罗非鱼海豚链球菌。

本发明检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒使用方法如下:

取样本DNA加入到反应液中，作为样品检测组，然后分别在阳性标准品、阴性标准品以及样品检测组中加入DNA聚合酶，混合均匀后进行荧光定量PCR反应，其中反应液、阳性标准品、阴性标准品中均含有上游引物的序列SEQ ID NO:1、下游引物的序列SEQ IDNO:2和特异性探针的序列SEQ ID NO:3。

样本预处理：

采集待检鱼的脑、头肾、肝、脾、眼等组织，用细菌DNA提取试剂盒提取核酸作为模板，待用。