[发明专利]一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法

权利要求书

1.一种快速鉴定分枝杆菌的引物，其特征在于，所述引物为以分枝杆菌Hsp65基因为靶向基因、基于PCR扩增技术设计的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为：5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’，下游引物为：5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’。

2.一种快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、从标本中提取总的细菌DNA；

S2、以步骤S1所述的总的细菌DNA为模板DNA，利用权利要求1中所述的引物进行PCR扩增，PCR扩增反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min，结束后4℃保存；

S3、通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果，并对扩增产物进行纯化；将纯化后的PCR扩增产物进行常规Sanger测序；

S4、对Sanger测序法得到的基因序列进行分析和处理，获得检测标本中Hsp65靶向基因的序列，将Hsp65靶向基因的序列在NCBI数据库中进行比对，确定分枝杆菌的菌种类型。

3.根据权利要求2所述的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中的标本选自痰液、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、腹膜液、尿液、羊膜水、外周血和组织标本中的一种。

4.根据权利要求2所述的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增反应的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、模板DNA2μL、上游引物1μL、下游引物1μL和ddH₂O 8.5μL；所述上游引物和下游引物的浓度为10pmoL/μL。

5.根据权利要求2所述的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，所述分枝杆菌包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、、田鼠分枝杆菌(M.microti)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、牛分枝杆菌(M.bovis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、猿猴分枝杆菌(M.simiae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、海分枝杆菌(M.marinum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、鸟分枝杆菌(M.avium)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、次要分枝杆菌(M.triviale)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、土地分枝杆菌(M.terrae)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、龟分枝杆菌龟亚种(M.chelonae subsp.chelonae)、龟分枝杆菌脓肿亚种(M.chelonae subsp.abscessus)、施氏分枝杆菌(M.shimoidei)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistibile)、田野分枝杆菌(M.agri)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、草分枝杆菌(M.phlei)。