[发明专利]灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法

权利要求书

1.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合物由以下4条引物组成：

F3：CCTAATCAAATGGCTAAACGTATT；

TB3：CGTACAGTAACCATGGGATA；

FIP：TGAGAATCACCTAAGAGTGAACCATGCTTTTAAACGAATAGGACCG；

BIP：CCGATTACATGGAAACGGAACTCAAAAGTCATGCAGTCACAAT。

2.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP引物组合物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组合物的浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含：10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgCl₂、甜菜碱、羟基萘酚蓝、8U/μL Bst DNA聚合酶、ddH₂O。

5.用于检测含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：25μL反应体系由以下成分组成：8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱4.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝1μL、DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL。

6.根据权利要求5所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：

利用所述25μL检测反应体系进行LAMP扩增反应，扩增结果的分析和判定方法为选择以下任一：

方法一、先在扩增前加入染料羟基萘酚蓝作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，然后进行LAMP扩增反应，反应结束后，颜色发生变化，即显色结果为天蓝色判断为阳性，即显示检测到含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌；颜色没有发生变化，显色结果仍为蓝紫色判断为阴性，即显示样品无含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，或所含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌含量未达检测限；

方法二、取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示无含有BCbi143/144内含子的灰霉病菌，或所含的有BCbi143/144内含子的灰霉病菌未达检测限。

7.根据权利要求6所述的环介导等温扩增方法，其特征在于LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。

8.根据权利要求7所述的环介导等温扩增方法，其特征在于：所述方法一、方法二中的检测限DNA浓度为1pg/μL。