[发明专利]一种水产动物保健品中磺胺嘧啶抗生素含量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水产动物保健品中磺胺嘧啶抗生素含量的检测方法，属于水产科学领域。

背景技术

我国是水产养殖大国，产量一直居于世界首位。高密度的养殖方式是获得高产量的保证，但也易引起各种鱼病的暴发。因此，预防为主、防治结合一直是水产养殖过程防控病害、促进生长的基本法则。水产动物保健品在预防、治疗鱼类疾病、保障鱼类健康生长，以及在节省资源和保证生物安全等方面有着重要作用，并已经成为养殖过程日常管理的必备投入品。例如，复合维生素类保健品通过泼洒和饲料拌喂等方式进入水产动物体内，具有增强免疫和预防疾病等功效，中草药粉剂和多种微量元素复合制剂也标识这些类似的功效。

与国外发达国家动物保健品企业相比，我国水产动物保健品企业无论在研发、生产、销售环节均存在较大的差距此，更为关键的是，国外以药物残留为借口，对我国动物源性产品提高了贸易技术壁垒。磺胺嘧啶正是被广泛隐性添加使用的抗生素之一。磺胺嘧啶作为广谱抑菌剂，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抑制作用，可用于治疗由气单胞菌属、假单胞菌属、弧菌属和链球菌属引起的水产动物的细菌性疾病。

目前已报道水产品、水产养殖环境(水体和沉积物)中磺胺嘧啶的检测方法。这些方法考虑了生物体及其生活环境介质中磺胺嘧啶的提取和纯化手段。而水产动物保健品的基质特殊，复杂，至今未见相关报道。因此需要开发新型的抗生素提取和纯化程序，以及与之匹配的液相色谱流动相配比和质谱条件来定性和定量。

发明内容

本发明的目的是得到一种水产动物保健品中磺胺嘧啶抗生素含量的检测方法，其优点是检测灵敏度高、精密度好和时间短。

按照本发明提供的技术方案，一种水产动物保健品中磺胺嘧啶抗生素含量的检测方法，步骤如下：

(1)标准曲线制备：取磺胺嘧啶标准溶液，利用色谱纯级别的甲醇来溶解、稀释成浓度为1mg/L的母液；把母液再次稀释成5个不同浓度，即0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和50μg/L的磺胺嘧啶标准工作液；通过设备对所得标准工作液进行检测，获得实测数据，并绘制磺胺嘧啶抗生素含量与检测结果之间的标准曲线图；

(2)检测：对待测的水产动物保健品进行处理，得到样品后采用设备进行检测，得到实测数据；

(3)对比：将步骤(2)所得实测结果与步骤(1)中获得的标准曲线图进 行比对，即可得到样品中磺胺嘧啶抗生素的含量。

步骤(1)和(2)所用检测设备为超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪。

步骤(2)所述处理方法如下：

a、称量：精确称取5g样品粉末，溶解到1000mL蒸馏水中，摇荡5分钟，然后超声5分钟；静置30分钟后，进行下一步操作；

b、过滤：缓慢将步骤a所得上层澄清液倒入过滤装置，通过玻璃纤维滤膜进行过滤；

c、处理：在步骤b所得过滤液中加入0.2g乙二胺四乙酸二钠Na₂EDTA，摇匀；用4M的硫酸调节pH至3.0，然后加入50mL色谱纯级别的甲醇；

d、固相提取：用10mL甲醇和10mL超纯水分别活化固相提取小柱，再往柱子里面加载步骤c中处理好的溶液；加载完毕后用10mL超纯水润洗小柱，抽干柱子；

e、保存：用2mL色谱纯级别的甲醇洗脱柱子并收集洗脱液，并过0.22μm有机相滤头，最后保存于2mL棕色进样小瓶中；

f、取样：取出300μL步骤e中得到的溶液与300μL蒸馏水混合后用于检测。

所述超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪的色谱分离方法如下：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18column，2.1×50mm，i.d.＝1.7μm；柱温：40℃；流速：0.5mL·min^-1；进样体积：5μL；

流动相梯度：

溶液A：含0.1％甲酸的甲醇；

溶液B：乙酸：水＝1:81；

程序梯度：Initial,A:B＝5:95；1min,A:B＝9.5:90.5；2.2min,A:B＝23:77；4min,A:B＝45:55；4.2min,A:B＝75:25；4.21min,A:B＝9.5:90.5；6min,5:95；

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源ESI+；采集方式：多反应检测模式MRM；毛细管电压3.5V；离子源温度150℃；脱溶剂气温度450℃；脱溶剂气流速800L/Hr；锥孔气流速50L/Hr；碰撞能量3V。