[发明专利]一种确定鸭Hsp90α蛋白结合磷脂酰胆碱区域的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种确定鸭Hsp90α蛋白结合磷脂酰胆碱区域的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

热休克蛋白Hsp12不像其他热休克蛋白一样保护其他蛋白免于去折叠和降解，而是结合到细胞膜上稳定细胞膜防止其发生破裂和泄漏。

热休克蛋白(Heat shock protein，Hsp)是生物中广泛存在的一类高度保守蛋白质，也是膜结合蛋白之一。按照分子量的大小，Hsp共分为5类，分别是Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60以及小分子蛋白。正常机体细胞内的热休克蛋白可作为分子伴侣，参与蛋白质的跨膜转运和折叠等。在机体处于胁迫状态时，热休克蛋白能提高表达与细胞内各组分如膜、蛋白质、细胞骨架元件等相互作用，维持细胞的稳定。热休克蛋白对细胞膜的流动性、渗透性、完整性具有调控作用。在酵母细胞中，Hsp12结合到细胞膜上稳定细胞膜防止其发生破裂和泄漏；在乳酸菌中，小分子热休克蛋白可以与细胞膜作用维持膜脂的结构和状态。磷脂是细胞尤其是细胞膜磷脂双分子层的重要组分，两者间关系密切。小分子热休克蛋白和Hsp70与磷脂的结合已有报道。Harada等用非变性PAGE检测了Hsp70的N端ATPase功能区和C端多肽结合区能够与酸性糖脂和磷脂结合，而与中性糖脂和磷脂则不能结合；McCallister等用超速离心的方法检测到Hsp70的N端和C端都能结合磷脂，只是N端比C端结合的磷脂的量多。非变性PAGE和超速离心的方法常得出相反的结果，并且不能实时观测结合的动力学和亲和力。到目前为止未见过对Hsp90α结合磷脂的区域的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种确定鸭Hsp90α蛋白结合磷脂酰胆碱区域的方法，通过分段表达鸭Hsp90α蛋白，借助表面等离子共振技术实时观测各鸭Hsp90α蛋白片段与磷脂结合的动力学和亲和力，确定鸭Hsp90α蛋白与磷脂结合的区域。

本发明的技术方案，一种确定鸭Hsp90α蛋白结合磷脂酰胆碱区域的方法，步骤如下：

(1)鸭Hsp90α基因及各片段基因序列的获得：

a、鸭Hsp90α基因提取：取鸭胸肌100mg，提取总RNA，总RNA经电泳检测，采用核酸定量分析仪测定OD_260/280比值及浓度，以1μg总RNA为模板，按照cDNA合成试剂盒说明书进行反转录；反转录程序：37℃15min，85℃5min，4℃保存，长期保存应放于-20℃；

b、特异性引物的设计：根据北京鸭的Hsp90α基因序列设计系列基因特异性引物，包括：上游引物F，下游引物R，以及分段用特异性引物N-R、M-F、M-R、C-F和C-R；

c、PCR扩增：以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；PCR产物纯化回收后连接至pCold1载体，转化至DH5α感受态细胞，将菌液涂在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，然后挑取阳性单菌落进行培养，经菌落PCR及双酶切鉴定重组质粒，对正确的重组质粒进行测序，将测序无误的重组质粒分别转化进入表达感受态细胞Transetta2；

(2)融合蛋白原核表达及可溶性分析：以阳性重组质粒转化步骤(1)所得大肠杆菌Transetta2感受态细胞，挑取单菌落接种至5mL含100μg/mL氨苄的LB培养基中，37℃，200r/min震荡培养，当菌液浓度OD₆₀₀值为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.25mM，22℃，200r/min摇晃诱导过夜；用不加IPTG诱导的菌液做对照，离心收集沉淀，用PBS重悬沉淀，于超声波细胞破碎仪上破碎4-6min，11000-13000r/min离心4-6min，分别取出上清、沉淀，加入SDS-PAGE电泳上样缓冲液，95℃加热10min，用12％SDS-PAGE电泳检测融合蛋白是否为可溶性蛋白；

(3)重组融合蛋白的诱导表达及纯化：

d、诱导表达：将步骤(2)鉴定所得能可溶性表达的菌落接种于500mL含LB培养基中进行诱导表达；4400-4600r/min离心14-16min收集菌体，用pH为7.6含有50mM的磷酸盐，150mM的NaCl，5mM的咪唑的Binding Buffer缓冲液重悬菌体，冰浴条件下超声破碎18-22min，超声参数为：功率20％，超声1s，间停3s、再11000-13000r/min离心28-32min，4℃收集上清，弃菌体沉淀；