[发明专利]一种侵染生姜的黄瓜花叶病毒抗血清的制备方法

说明书

技术领域

一种制备侵染生姜的黄瓜花叶病毒抗血清的制备方法，属免疫技术领域。

背景技术

黄瓜花病毒(CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucurnovirus)的典型成员，具有典型的三分体正义单链RNA (ssRNA)病毒的特点。CMV的寄主范围十分广泛，它能侵染包括茄科、十字花科、豆科等1000多种植物，对经济作物产生严重危害。CMV侵染生姜后出现花叶、矮化或者褪绿，且这些症状往往是复合出现。CMV因其发生的普遍性和所引起病害的严重性，是目前研究最多的植物RNA病毒之一。

生姜(Zingiber offcinale Rosc．)为姜科姜属多年生宿根草本植物，侵染生姜并引起严重危害的病毒主要是黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV) 和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)。由于生姜采用无性繁殖，病毒逐年积累，病毒危害也逐年加重，病毒病可导致生姜减产30-50%，且影响品质。目前没有防治病毒病的有效药物，解决病毒病的途径是通过筛选无病毒生姜进行繁育，建立种子基地，用无病毒良种栽培。

虽然检测植物病毒的方法有多种，但间接ELISA法是最常用的方法，每次可以检测几十乃至上百个样品，是一种经济、实用的方法，成本也低。由于市场上没有能检测侵染生姜的黄瓜花叶病毒的抗血清，脱毒生姜种苗的质量多通过目测或者指示植物方法确定是否脱毒完全，既缺乏科学性又费时。本发明制备检测侵染生姜的黄瓜花叶病毒抗血清，可大大方便该病毒的检测。

发明内容

本发明用感染黄瓜花叶病毒的生姜叶片为材料，首先粗提取病毒颗粒，然后通过5-20%梯度SDS-PAGE分离其外壳蛋白，切下乳白色外壳蛋白（CP）条带，将含CP的凝胶磨细后免疫注射小鼠，获得高效价的抗黄瓜花叶病毒血清。

本发明的具体技术方案如下：

一种制备侵染生姜的黄瓜花叶病毒抗血清的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、粗病毒的提取将黄瓜花叶病毒侵染的生姜病叶匀浆，过滤和低速离心去除大的固体杂质，四氯化碳去除叶绿素，加入聚乙二醇6000（PEG6000）、NaCl和Triton-X 100后静置使病毒粒子沉淀，用20%蔗糖垫进一步纯化获得的黄瓜花叶病毒颗粒， 将其溶解于PBS中，得到病毒悬液，于-80°C储存备用；

b、黄瓜花叶病毒外壳蛋白的5-20% SDS-PAGE梯度分离纯化将病毒悬液与等体积的1.5-2.5倍SDS上样缓冲液混合，沸水浴加热8-12分钟，冷却后离心除去沉淀，然后将样品加入制备型的5-20% SDS-PAGE梯度凝胶板中电泳，完毕后凝胶用4°C的0.25M KCl浸泡染色，切下乳白色的黄瓜花叶病毒外壳蛋白条带，平分3-5份；

c、将含外壳蛋白的凝胶加生理盐水磨细后，免疫注射3-5只小鼠，4次免疫注射，两次之间间隔6-7天，第一次注射方式为皮下注射0.24-0.26 mL,腹腔注射0.24-0.26 mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射0.48-0.52 mL，第四次注射后第3天断头取血，6小时后离心获得抗血清。

所述的抗血清制备方法制得的抗血清。

所述的抗血清在侵染生姜黄瓜花叶病毒检测上的应用。

本发明技术效果体现在几个方面：

1、制备的抗血清特异性强

由于采用梯度制备电泳的方法纯化黄瓜花叶病毒的外壳蛋白（CP），纯化的CP特别纯，不含其他蛋白，因此制备的抗血清只与黄瓜花病毒CP作用，特异性很强；

2、不使用昂贵的福氏佐剂，降低抗血清的生产成本

本发明将外壳蛋白（CP）包埋在网状的聚丙烯酰胺凝胶中，外壳蛋白（CP）从网状的聚丙烯酰胺凝胶中缓慢释放到动物体内，抗原在动物体内停留时间长，充分刺激免疫系统，用聚丙烯酰胺凝胶替代了昂贵的福氏佐剂。

具体实施方式

实施例一：

第一步：粗病毒的提取

（1）取100 g黄瓜花叶病毒侵染的生姜病叶匀浆，加入400 mL的Buffer A (0.5 mol/L 磷酸钾缓冲液，含0.1 % 2-巯基乙醇，0.01 mol/L EDTA，pH 7.0)，用4层纱布过滤，经低速离心（5,000 g）15 分钟去除固体杂质；

（2）将上清液加1/4体积的四氯化碳（CCl₄）剧烈搅拌5 分钟，低速离心（5,000 g）20 分钟去除沉淀的叶绿素；