[发明专利]抗CEA抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体

说明书

本发明公开了一种抗CEA抗原的VHH结构域及单域抗体，以及含有两种VHH结构域的双特异性抗体，所述抗体由两条不同的重链序列融合而成，可以分别识别CEA抗原的不同表位。所述VHH结构域、单域抗体以及双特异性抗体均具有优异的抗体识别能力，显著的ADCC效应、并具有较长的体内半衰期，在体内外诊断和药物制备领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明公开了一种多肽，更具体地，公开了一种抗体，属于免疫学技术领域。

背景技术

癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。CEA容易自细胞表面切割，并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性，已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症。而且，CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。

更重要的是，CEA已成为用于靶向治疗的潜在有用的肿瘤相关抗原。已经报道的使用CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种主要方法：一种方法使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与例如药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。

目前已经针对CEA生成多种单克隆抗体。Chester等已经自噬菌体展示文库分离出单链抗CEA抗体以在放射性免疫检测和放射性免疫疗法中使用(美国专利No.5,876,691)，随后将抗体人源化(美国专利No.7,232,888)。放射性标记的抗CEA抗体已经在结肠直肠癌患者的临床试验中使用。

1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一种天然缺失轻链的抗体，即，仅有重链的抗体(heavychain-only-likeAntibody，HCAbs)，由于该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域，因此该类抗体又称为单域抗体。该类抗体不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。VHH结构域的晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)，单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。

相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体或者单域抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。因此，纳米抗体或单域抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。但是，基于单表位识别抗体存在的结构性缺陷也同时制约着该类抗体的进一步应用。这是因为传统的天然抗体虽然是双价抗体，但是两组相同的重链和轻链组合，只能识别和结合相同的抗原表位，这种单价的线性结合不仅会使识别和结合的能力低下，还会因为结合表位的缺失和变异而难以完成识别和结合的目的。

双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对同一抗原不同表位的双价抗体。