[发明专利]一种降解土壤中抗生素的混合菌剂及其制备方法

权利要求书

1.一种降解土壤中抗生素的混合菌剂，其特征在于，是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按(0.1-3)∶1的体积比混合而成。

2.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂，其特征在于，是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按0.1∶1的体积比混合而成。

3.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂，其特征在于，是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按0.5∶1的体积比混合而成。

4.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂，其特征在于，是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按1∶1的体积比混合而成。

5.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂，其特征在于，是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按1.5∶1的体积比混合而成。

6.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂，其特征在于，是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按2∶1的体积比混合而成。

7.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂，其特征在于，是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按2.5∶1的体积比混合而成。

8.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂，其特征在于，是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按3∶1的体积比混合而成。

9.一种如权利要求1-8中任一项所述降解土壤中抗生素的混合菌剂的制备方法，其特征在于，制备过程如下：

㈠、混悬液配制：取抗生素污染的土壤，按1：9的重量比加入到灭菌水中，搅拌成混悬液，备用；

㈡、菌落培养：

①、培养基制备：分别取NaCl 0.1g、KH₂PO₄0.05g、K₂HPO₄ 0.15g、NH₃NO₃ 0.1g、MgSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂1.5g，混合均匀，加蒸馏水至100ml，调节pH值至5.5～7.5，再高压灭菌后冷却至50℃，然后，加入土霉素，使其终质量浓度为100mg/L，即得土霉素基础盐固体培养基，备用；

②、培养：将混悬液用灭菌水10～120倍比稀释，然后涂布于土霉素基础盐固体培养基平板上，在25～37℃下，培养1～3天，成为培养菌落，备用；

㈢、菌株分离：在经过培养的土霉素基础盐固体培养基平板上挑取单菌落，通过平板划线，分离纯化出细菌菌株，再经生理生化和16S rDNA测序鉴定，保留枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)J5P2和假单胞菌(Pseudomonas sp.)J2，备用；

㈣、传代驯化：

①、驯化：将分离纯化的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株，再经土霉素基础盐固体培养基传代驯化，其方法是：将枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株接种入质量浓度为100mg/L的土霉素基础盐固体培养基上，在25～37℃下培养1～3天后；再接种入质量浓度为200mg/L的土霉素基础盐固体培养基上，在25～37℃下培养1～3天，……，以此类推，连续传代培养，每次使土霉素质量浓度增加100mg/L，至土霉素最终质量浓度达500mg/L，完成传代驯化，分别成为驯化后的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株，备用；

②、LB培养基制备：分别取胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g，加蒸馏水至100mL，摇动容器，直至溶质溶解,用5mol/L的NaOH调节pH值至7.0,再用去离子水定容至1L,然后在15psi高压下蒸汽灭菌18-24min，即得LB培养基，备用；

③、保存：将驯化后的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株分别接种于LB培养基斜面，制成斜面菌种，-4℃保存，备用；

㈤、种菌液制备：在pH值5.5～7.5的条件下，取保存的枯草芽孢杆菌J5P2斜面菌种和假单胞菌J2斜面菌种，在土霉素质量浓度为100mg/L的土霉素基础盐培养基上活化24h～72h后，分别挑取枯草芽孢杆菌J5P2的单菌落和假单胞菌J2的单菌落接种于LB培养基中培养至对数生长期，5000r/min离心10min，收集菌体，经0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗涤3次，再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl调整菌液浓度，使其浓度为1×1010个/mL±0.5％，分别成枯草芽孢杆菌J5P2种菌液和假单胞菌J2种菌液，备用；

㈥、混合菌剂制备：将枯草芽孢杆菌J5P2种菌液和假单胞菌J2种菌液按(0.1～3)∶1的体积比混合，即成降解土壤中抗生素的混合菌剂。

10.根据权利要求9所述降解土壤中抗生素的混合菌剂的制备方法，其特征在于，制备过程如下：

㈠、混悬液配制：取抗生素污染的土壤，按1：9的重量比加入到灭菌水中，搅拌成混悬液，备用；

㈡、菌落培养：

①、培养基制备：分别取NaCl 0.1g、KH₂PO₄0.05g、K₂HPO₄ 0.15g、NH₃NO₃ 0.1g、MgSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂1.5g，混合均匀，加蒸馏水至100ml，调节pH值至6.5，再高压灭菌后冷却至50℃，然后，加入土霉素，使其终质量浓度为100mg/L，即得土霉素基础盐固体培养基，备用；

②、培养：将混悬液用灭菌水100倍比稀释，然后涂布于土霉素基础盐固体培养基平板上，在30℃下，培养2天，成为培养菌落，备用；

㈢、菌株分离：在经过培养的土霉素基础盐固体培养基平板上挑取单菌落，通过平板划线，分离纯化出细菌菌株，再经生理生化和16S rDNA测序鉴定，保留枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)J5P2和假单胞菌(Pseudomonas sp.)J2，备用；

㈣、传代驯化：

①、驯化：将分离纯化的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株，再经土霉素基础盐固体培养基传代驯化，其方法是：将枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株接种入质量浓度为100mg/L的土霉素基础盐固体培养基上，在30℃下培养2天后；再接种入质量浓度为200mg/L的土霉素基础盐固体培养基上，在30℃下培养2天，……，以此类推，连续传代培养，每次使土霉素质量浓度增加100mg/L，至土霉素最终质量浓度达500mg/L，完成传代驯化，分别成为驯化后的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株，备用；

②、LB培养基制备：分别取胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g，加蒸馏水至100mL，摇动容器，直至溶质溶解,用5mol/L的NaOH调节pH值至7.0,再用去离子水定容至1L,然后在15psi高压下蒸汽灭菌21min，即得LB培养基，备用；

③、保存：将驯化后的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株分别接种于LB培养基斜面，制成斜面菌种，-4℃保存，备用；

㈤、种菌液制备：在pH值6.5的条件下，取保存的枯草芽孢杆菌J5P2斜面菌种和假单胞菌J2斜面菌种，在土霉素质量浓度为100mg/L的土霉素基础盐培养基上活化48h后，分别挑取枯草芽孢杆菌J5P2的单菌落和假单胞菌J2的单菌落接种于LB培养基中培养至对数生长期，5000r/min离心10min，收集菌体，经0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗涤3次，再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl调整菌液浓度，使其浓度为1×1010个/mL±0.5％，分别成枯草芽孢杆菌J5P2种菌液和假单胞菌J2种菌液，备用；

㈥、混合菌剂制备：将枯草芽孢杆菌J5P2种菌液和假单胞菌J2种菌液按(0.1～3)∶1的体积比混合，即成降解土壤中抗生素的混合菌剂。