[发明专利]一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用

说明书

本发明属于生物医用高分子材料领域，公开了一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用。本发明载体材料结构如通式(1)所示：其中，R₁为苄基、烷基或聚乙二醇，n为聚合度，x为侧链不含双键的重复单元的聚合度，且x<n。本发明载体材料，其侧链含伯胺阳离子，能有效地与siRNA形成聚电解质纳米复合胶束，向肿瘤细胞内传递siRNA，转染效率非常好，可与高效率载体PEI相媲美，但细胞毒性比PEI低的多，甚至没有细胞毒性。本发明还提供了一种上述载体材料的制备方法，可低成本、大批量地制备转染效率高、细胞毒性低的非病毒类基因载体，在肿瘤和多种免疫疾病的基因治疗方面有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，特别涉及一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用。

背景技术

近二十年来，基因疗法是被认为是一种治疗肿瘤和多种免疫疾病的有效方法。它是将正常基因或具有修复作用的质粒(pDNA)通过一定的方式导入靶细胞来纠正基因缺陷，从而达到治疗目的；或者是通过特定方式将具有沉默功能的小干扰RNA(siRNA)导入靶细胞来沉默致病基因的表达，从而达到治疗的目的。要达到这样的目标，必需将外源基因负载到合适载体上，然后将基因递送至靶细胞，载体起到保护基因的目的，否则其将被核酸酶降解，以至于导致基因治疗失败。因此，对能够负载并保护基因的载体材料的选择，就变得非常关键。病毒具有携带基因转染细胞的天然生物功能，因此可以高效率的将外源基因导入到靶细胞，效率非常高。常用的病毒载体主要有腺病毒，逆转录病毒和慢病毒等，虽然转染效率高，但病毒载体的致命缺陷是能够引发免疫响应而导致患者死亡(N.S.Templeton,Bioscience Reports,2002,22,283-295)。此外，病毒也具有不能够大批量制备、成本高、运载基因容量有限等缺点(D. Ibraheem,A.Elaissari,H.Fessi,International Journal ofPharmaceutics,2014,459: 70–83)。针对此缺点，研究者根据基因自身带负电的结构特点，使带阳离子的化合物与基因通过静电吸引作用来形成纳米尺度的复合物胶束，从而保护基因，安全性比病毒载体大大增加。非病毒载体主要有阳离子脂质体、阳离子聚合物以及阳离子无机化合物等。阳离子脂质体的应用最为广泛，但阳离子脂质体为小分子物质，带正电荷较少，与基因结合能力不够强，转染效率也不高。更为关键的是，脂质体每个分子带正电荷数少，因此完全中和基因的负电荷时的投料量就很大，这大大增加了脂质体类载体的细胞毒性。事实上，载体的安全性一直是困扰基因疗法的瓶颈，例如，1999年，一例患肝病的18岁病人Jesse Gelsinger在使用基因疗法的过程中死亡，这次事件导致全球基因疗法的临床试验基本停止(N.S.Templeton,Bioscience Reports,2002,22,283-295)，这是基因疗法发展历史上的重大挫折。病人死亡的原因是腺病毒载体(AV)使病人的免疫系统过度反应，引发患者多器官衰竭和脑死亡。尽管基因治疗一直在曲折中前进，今年的麻省理工学院技术评论仍将基因治疗技术评为“2017年十大技术突破”之一(E.Mulin,MIT technologyreview,2017,March/April)，这直接得益于2012年以来更为安全的腺相关病毒载体(AAV)的使用。尽管如此，病毒载体由于自身本性的限制，安全性仍是无法避免的问题。由此看来，开发更为安全、低细胞毒性以及高转染效率的新型非病毒类聚合物载体，无疑仍旧是解决基因疗法瓶颈的关键。

发明内容

为了克服上述现有技术非病毒载体的细胞毒性的缺点与不足并保证转染的高效性，本发明的首要目的在于提供一种基于阳离子多肽类的细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料。

本发明的载体材料为侧链含有伯胺离子的多肽类载体，可有效地和siRNA 结合形成纳米复合物胶束，可向靶细胞中传递siRNA，细胞毒性低，甚至无细胞毒性；转染效率好，可与经典的高效率转染载体聚乙烯亚胺(PEI)相媲美。

本发明另一目的在于提供一种上述非病毒基因转染载体材料的制备方法。