[发明专利]一种膜蛋白MscL融合载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种膜蛋白MscL融合载体及其构建方法。

背景技术

生物膜离子通道是各种无机离子跨膜被动运输的通路。离子通道的开放和关闭，称为门控，根据门控机制的不同，离子通道分为电压门控性，配体门控性，和机械门控性。

机械门控性，即机械敏感性离子通道(Mechanosensitive，MS)是指一类感受细胞膜表面应力变化，实现胞外机械信号向胞内转导的通道，根据通透性分为离子选择性和非离子选择性通道，根据功能作用分为张力激活型和张力失活型离子通道。当活细胞和有机体受到环境中的机械刺激时，机械信号随即转化成生物信号，使细胞作出反应，此过程被称为机械转导。生物体对机械刺激产生反应和适应的能力在许多生理现象中表现重要作用，例如听觉和平衡的产生、体液平衡和血压、多精受精的防止、细胞体积和形状调控、细胞移动、组织生长和形态发生等。机械刺激包括高频震动、渗透压的变化、静水压和液体的剪切力等。机械信号的转导有多种途经，每种途径都能筛选出相关的刺激和过滤掉无关的刺激。在机械信号转导过程中，机械敏感性离子通道(mechanosensitive channel)起了很重要作用。

根据导电能力的大小，机械敏感性离子通道又分为两种：一是高导电机械敏感性离子通道(The mechanosensitive channel of large conductance，MscL)，二是低导电械敏感性离子通道(The mechanosensitive channel of small conductance，MscS)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种膜蛋白MscL融合载体，所述融合载体中的膜蛋白MscL的表达量及其稳定性显著提高，同时载体中嵌入了GFP蛋白的基因片段，实现了膜蛋白MscL的可视化表达。

实现上述目的的技术方案如下：

一种膜蛋白MscL融合载体，为依次将MscL蛋白和GFP蛋白的基因片段嵌入pET-28a质粒中形成的全长序列为SEQ NO.7的融合载体。

进一步地，本发明还提供上述膜蛋白MscL融合载体的构建方法，具体步骤如下：

步骤1，构建机械敏感通道蛋白MscL融合载体：PCR扩增得到上游含有Nde I限制性核酸内切酶位点，下游含有Hind Ⅲ限制性核酸内切酶位点的机械敏感通道蛋白MscL的cDNA，双酶切MscL的cDNA和pET28a载体，连接反应得到pET28a-MscL-His载体。

步骤2，构建水母绿色荧光蛋白GFP融合载体：PCR扩增得到上游含有Hind Ⅲ限制性核酸内切酶位点，下游含有Not Ⅰ限制性核酸内切酶位点的绿色荧光蛋白GFP的cDNA，双酶切GFP的cDNA和pET28a-MscL-His载体质粒，连接反应得到pET28a-MscL-GFP-His载体；

本发明与现有技术相比，具有以下显著效果：

(1)本发明的膜蛋白MscL融合载体能够表达水母绿色荧光蛋白GFP，表达目的蛋白的菌体和常规菌体在颜色上有明显差异，能够实现可视化表达，可以直观看到膜蛋白MscL是否正确表达，简化后续的验证；

(2)与常规表达相比，膜蛋白MscL的产量有明显提高，产量提高了近20倍，为后续研究提供了充足的样品；

(3)与常规表达相比，表达得到的膜蛋白MscL的稳定性显著增强。

附图说明

图1为MscL PCR琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为pET28a-MscL-His质粒图谱。

图3为GFP PCR琼脂糖凝胶电泳结果。

图4为pET28a-MscL-GFP-His质粒图谱。

图5为anti-His Western Blot验证实验结果图。

图6为融合表达MscL-GFP菌体(a)和常规菌体(b)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。本发明实施例中的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识。

实施例中所用材料如下：

1.细胞来源

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)细胞购自武汉灵淼生物公司。

2.表达载体来源

pET28a购自MERK公司

3.引物来源

合成引物均来自上海生工生物有限公司

4.主要试剂