[发明专利]瘿椒树亲缘关系鉴定方法

说明书

本发明公开了一种瘿椒树亲缘关系鉴定的方法，对不同居群的样本材料进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色拍照并记录结果，利用获得的[0,1]数据矩阵表用遗传分析软进行分析，准确的对不同种群之间进行了亲缘关系分析，构建遗传关系树状图，区分了不同的种群。同时，用此方法对不同居群不同性别间的遗传演化关系进行了研究，推测瘿椒树目前的雄全异株繁育系统由最原始两性繁育而来。本发明反应稳定、扩增片段清楚、多态性高，能准确快速对瘿椒树不同种群间的亲缘关系和遗传多样性进行分析，能快速、准确地进行聚类分析，区分不同种群。

技术领域

本发明属于苗木育种技术领域，涉及一种苗木育种的检测方法，具体涉及一种瘿椒树亲缘关系鉴定的方法。

背景技术

瘿椒树(Tapiscia sinensis Oliv)属于瘿椒树科，是一种多年生落叶乔木，种群中雄株和两性株异株(雄全异株)，雄株不结果，两性植株6月初完成受精,受精后果实进入休眠状态直至第二年三月才开始发育，其自然种群中两性花可以产生可育花粉。瘿椒树为我国特有的古老的第三纪古热带孑遗树种，国家三级保护植物。其作为一种古老濒危树种，在研究生物进化，植物繁育系统演化，性别决定机制方面具有重要理论意义。

SRAP(Sequence-Related Amplfied Polymorphism，序列相关扩增多态性)DNA分子标记技术是美国加州大学Li与Quiros于2001年中开发出来的一种新型的基于PCR的双引物分子标记技术。其利用正向引物的CCGG与外显子区域结合而反向引物的AATT与内含子区域和启动子区域结合的特点对基因保守的ORF(open reading frame，开放阅读框)进行扩增，扩增结果与表型/基因型具有密切相关性，同时因为其具有很高的操作简易性和扩增多态性，SRAP标记在物种种群遗传结构及亲缘关系分析中得到了广泛的应用。目前已经成功应用于甘蓝，西葫芦，野牛草，棉花，荔枝等作物遗传多样性、品种鉴定、遗传图谱构建，遗传亲缘关系分析等方面。

瘿椒树传统的育苗方式主要两种类型,即有性繁殖和无性繁殖,有性繁殖以种子繁殖为主。在苗木育种亲本选配中，传统方法依靠育种学家的田野形态鉴定手段，这在很大程度上限制了新品种选育的准确性和可靠性，分子标记的手段则有助于在育种之前提前理清育种材料之间的亲缘关系，大大节省了育种周期，节省了育种成本，提高了可靠性。在瘿椒树中利用SRAP分子标记方法进行亲缘关系鉴定和遗传多样性分析尚未见报道。

发明内容

鉴于现有技术存在问题，本发明的目的在于提供一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，该方法操作简单，周期短，成本低效率高，对于瘿椒树育种中亲本选配具有重要指导价值。

本发明采用以下技术方案来实现,包括如下步骤：

一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，包括以下步骤，

(1)提取不同居群瘿椒树基因组DNA，构建总DNA池、雄性DNA池和两性DNA池；

(2)分别以总DNA池、雄性DNA池和两性DNA池为模板进行SRAP-PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳及银染显色后得到多条多态性条带；

以总DNA池为模板时，采用的引物共10对，包括SEQ ID NO.1～NO.20；以雄性DNA池为模板或以两性DNA池为模板时，采用的引物共10对，包括SEQID NO.21-NO.40；

(3)根据所述多条多态性条带得到不同居群不同性别瘿椒树的DNA指纹图谱；

(4)根据DNA指纹图谱表分别得到不同居群和不同性别的瘿椒树亲缘关系树状图。

步骤(1)中提取基因组DNA是通过瘿椒树幼嫩叶片提取；构建DNA池具体步骤包括：将每个居群瘿椒树雄性基因组DNA和两性基因组DNA等重量混合构建对应居群总DNA池，每个居群瘿椒树雄性基因组DNA构成对应居群雄性DNA池，每个居群瘿椒树两性基因组DNA构成对应居群两性DNA池。