[发明专利]一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物及应用

权利要求书

1.一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括根据FokI(rs2228570)位点的单核苷酸多态性设计的特异性引物。

2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于，所述FokI(rs2228570)位点的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

3.一种检测儿童钙吸收基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的扩增引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性内切酶。

5.一种儿童钙吸收基因多态性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括使用如权利要求1或2所述的扩增引物或如权利要求3或4所述的试剂盒。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采集待检样本，提取样本DNA；

(2)使用如权利要求1或2所述扩增引物进行PCR扩增反应；

(3)使用限制性内切酶处理步骤(2)得到的扩增产物；

(4)向步骤(3)处理后的扩增产物进行凝胶电泳分析。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的提取样本DNA的具体步骤如下：

取口腔黏膜样本，加入蛋白酶K，45-53℃水浴过夜，煮沸5-15min，置于冰上1-5min，10000-15000r/min离心1-5min，取上清液，即得所述待测样本DNA；

优选地，所述蛋白酶K的浓度为10-30mg/mL，优选为15-25mg/mL，进一步优选为20mg/mL。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增反应的条件为：

(a)94℃预变性1min，1循环；(b)95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s，30个循环；(c)72℃延伸4min，1循环；(d)4℃保存；

优选地，步骤(3)所述限制性内切酶为RsaI内切酶和/或NcoI内切酶；

优选地，步骤(3)所述限制性内切酶处理的反应的条件为：35-40℃反应2-6h，优选为36-28℃反应2-5h，进一步优选为37℃反应3h。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采集待检样本，提取样本DNA：取口腔黏膜样本，加入蛋白酶K，45-53℃水浴过夜，煮沸5-15min，置于冰上1-5min，1000-15000r/min离心1-5min，取上清液，即得所述待测样本DNA；

(2)使用如权利要求1或2所述扩增引物进行PCR扩增反应：(a)94℃预变性1min，1循环；(b)95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s，30个循环；(c)72℃延伸4min，1循环；(d)4℃保存；

(3)使用RsaI内切酶处理步骤(2)得到的扩增产物：35-40℃反应2-6h；

(4)向步骤(3)处理后的扩增产物进行凝胶电泳分析。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述分析的结果判断如下：

若FokI(rs2228570)位点的凝胶电泳结果显示为1条带，303bp，则基因型为AA，则判定为具有儿童钙吸收低风险；

若FokI(rs2228570)位点的凝胶电泳结果显示为2条带，205pb、123bp，则基因型为GG，则判定为具有儿童钙吸收高风险；

若FokI(rs2228570)位点的凝胶电泳结果显示为3条带，303bp、205bp、123bp，则基因型为AG，则判定为具有儿童钙吸收中度风险。