[发明专利]外引物可降解的巢式PCR

权利要求书

1.一种用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于：在单个反应管/孔中巢式PCR完成以下步骤：

(1)外引物扩增：PCR管中加入修饰的外引物PCR反应液，并加入矿物油对PCR反应液进行密封，完成预定扩增程序；所述外引物PCR反应液中采用的外引物末端至中部含有1个或1个以上dU碱基和/或RNA碱基修饰，所述外引物PCR使用Taq、K Taq、H.K Taq,含1-2×常规量的dNTP底物和Mg²⁺缓冲液；

(2)内引物扩增：于矿物油表层下加入内引物PCR反应液稀释外引物PCR 2-4×倍体积，所述内引物PCR反应液中含有UDG和/或RNA酶，内引物PCR前50摄氏度2-10分钟消化、降解外引物PCR反应液中采用的所述含有1个或1个以上dU碱基修饰和/或RNA碱基修饰的外引物；内引物PCR反应液不含Mg²⁺。

2.根据权利要求1所述的用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于：所述内引物PCR反应液中采用的内引物为中部同序引物。

3.根椐权利要求1所述的用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于，所述含末端RNA碱基和含1-3个dU修饰的外引物中，修饰dU碱基和/或RNA碱基位列于3'末端/或末端和中部，且所述外引物PCR反应液中含有过量的dNTP底物和Mg²⁺。

4.根椐权利要求1所述的用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于：所述外引物PCR反应液中仅单侧采用外引物即单侧一条外引物含有所述dU碱基和/或RNA碱基修饰；其另一侧内引物与同侧外引物共用同一序列引物。

5.根椐权利要求1所述的用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于：所述外引物PCR反应液中的成分如下：dNTP,其中dA、dG、dC的终浓度是dT的2倍，含Mg²⁺终浓度3.5mM的缓冲液；

所述内引物PCR反应液与外引物PCR反应液体积相同，不含常规底物dA、dG、dC，含dUTP且与所述dT的终浓度相同。

6.根椐权利要求1所述的用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于：所述内引物PCR反应液中，UDG酶40×使用浓度为0.05-2.0U/μl，即5U/μl稀释2.5-10²倍；RNaseA酶40×使用浓度为0.4-40ug/ml，即4mg/ml稀释10²-10⁴倍，或RNaseI 5000U/ml。

7.根椐权利要求1的用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于：增敏荧光实时定量PCR时，外引物扩增12-15个循环；内引物扩增30-35个循环；

采用倍比稀释定量PCR时，样本于EP管进行倍比梯度稀释，即取样本10⁰～1×10^-9开始10×倍稀释5-10次或再等比稀释5-10个梯度，确保有靶分子管稀至无靶分子管的转折点落在梯度范围内，外引物扩增20个循环，内引物扩增30-35个循环。

8.根椐权利要求7的用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于：采用简易数字定量PCR时，内引物扩增30-35个循环后，每孔加入0.5μg/mL EB 2-5μL于矿物油层下面,置反应管于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。

9.根椐权利要求7所述的用于非诊断目的的外引物可降解的单管巢式PCR方法，其特征在于：待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至100-10000个反应单元的聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行所述外引物扩增和所述内引物扩增。