[发明专利]一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的实时定量PCR检测方法

说明书

本发明涉及海参养殖水体青苔爆发的防控与预警领域，具体地说是一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的动态监测方法。长石莼、硬石莼和萱藻是海参养殖池塘青苔爆发的重要种类，但其孢/配子个体较小，传统方法很难检测。通过针对三种大型藻类ITS区设计特异性引物，优化荧光定量PCR条件，最终利用定量PCR法实时监测养殖水体三种大型藻类孢子/配子的动态。结果显示，海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子量的动态变化与青苔爆发规律吻合较好。本发明提供的方法能够快速、有效、高灵敏度地监测海参养殖水体三种大型藻类的动态变化，为可能的青苔爆发提供预警。

技术领域

本发明涉及海参养殖水体青苔爆发的防控与预警领域，具体地说是一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的动态监测方法。

背景技术

“青苔”是对养殖水体中易爆发的大型藻类生物的俗称。近年来海参池塘养殖过程中，大型青苔藻类爆发有增加的趋势。大型藻类爆发，与有益微藻(硅藻等)竞争光、营养盐等限制性资源，导致饵料生物生长缓慢乃至缺乏，限制海参的生长；藻类爆发可能伴随着毒素的分泌，对海参造成生理胁迫和化学毒害；青苔的丝状结构会使海参困在其中，影响海参的运动和摄食；而且，藻类死后沉积在池底，在微生物作用下分解并消耗大量溶解氧，引起缺氧和底质腐败，并导致海参的缺氧死亡，给海参养殖产业带来巨大经济损失。

目前常用的防治办法有人工捞除，加入除草剂清除等。然而藻类一旦爆发，人工捞除后会伴随残余藻类组织或丝状体的再次大量增殖，耗费大量人工和物力财力，效果并不明显。除草剂的加入对于水体中的有益藻类、养殖生物(如海参)都会带来严重的刺激作用，破坏水体的生态平衡。因此，在爆发前期和非爆发期对大型藻类孢子/配子数量进行监控和预测，具有重要的现实意义。

然而，因孢子体和配子体等生殖细胞个体较小(10μm)，在光镜下不易与其他单细胞原生生物(如自养型及混合营养型鞭毛虫)相区别，仅通过传统形态学观察难以确定其数量或生物量，故无法实现对环境样品中大型青苔藻类孢子体与配子体的数量检测与动态监测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于基因层面的高灵敏度快速有效的分子生物学监测海参养殖池塘长石莼、硬石莼和萱藻(青苔常见种类)孢子/配子量动态的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的实时定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1)设计ITS区特异性引物：在长石莼(Ulva linza)、硬石莼(Ulva rigida)和萱藻(Scytosiphon lomentaria)18S rDNA序列右端和ITS序列区域分别查找涵盖部分ITS区或ITS区全长的物种特异性引物；分别选取序列相似性高于90％的同属或同科物种作为参考，进行特异性位点查找；使用Intergrated DNA Technologies(http://sg.idtdna.com/site)网站对所得特异性引物的GC含量，Tm值，引物二聚体形成，发卡结构产生等参数进行在线评估，筛选得出高质量引物对；

2)引物特异性验证：利用NCBI_{(National Center for Biotechnology Information)}的BLASTn功能和Primer-BLAST在线软件对步骤1)中所得引物的特异性进行验证；以实验室对照藻类和养殖水样DNA为模板，扩增其ITS序列，验证引物特异性和普适性；

3)定量PCR条件优化：利用包含目标片段的标准线性DNA构建标准曲线，回归系数达到0.98以上，扩增效率为大于90％；

5)定量PCR法实时监测海参养殖水体大型藻类孢子/配子的数量。

步骤2)扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性60s，55～57℃退火45s，72℃延伸60s，循环30～35次；72℃延伸10min。