[发明专利]基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法

说明书

本发明涉及抗原蛋白表达技术，具体涉及基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，通过设计重组家蚕核型多角体病毒BmNPV‑VP3‑cyHV‑polh，ORF72、ORF66、ORF81和ORF82的1‑186、993‑1197、603‑783、85‑186区域序列与家蚕质型多角体病毒结构蛋白VP3基因1‑279区域的编码序列串联融合序列由杆状病毒P10启动子控制；家蚕质型多角体蛋白基因由杆状病毒的多角体蛋白基因启动子控制。用该病毒接种家蚕或家蚕培养细胞，重组病毒表达的鲤疱疹病毒II型的抗原蛋白可包裹进家蚕质型多角体内。形成的多角体可以通过简单的差速离心实现纯化；纯化的多角体在碱性条件下裂解后，可以通过离心使多角体蛋白沉淀，而鲤疱疹病毒II型抗原留存在上清中，从而可以快速、方便地获得鲤疱疹病毒II型抗原。

技术领域

本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法。

背景技术

异育银鲫鳃出血病由鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2）感染引起，目前有关该病的防治主要从增强鱼的免疫能力、减少应激反应、混养、减少养殖密度、加强疾病的检测、及时去除患病鱼等方面进行控制。一般认为免疫预防是鱼类病毒性疾病防治最有效的方法之一。目前，鱼类的疫苗主要有灭活疫苗（死疫苗）、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗以及蛋白亚单位/DNA联合疫苗。灭活疫苗制备相对较容易，但免疫原性差，需含足够量的灭活病毒才能引起有效免疫应答，且该类疫苗不能进入主要组织相容性复合体I(MHC I)类抗原呈递途径,不能有效诱导细胞毒性T细胞（CTL）反应,因此，免疫效果相对不理想、免疫力持久性差。减毒疫苗免疫力强、作用时间长，但减毒疫苗生产成本高，有毒力返祖现象，安全性较差，有回复致病性的潜在危险。亚单位疫苗具有抗原性强、保护时间长、安全性好、制备和运输方便等优点，但是存在抗原表位丢失的不足，因此，新一代疫苗的研发方向是DNA疫苗；但至今没有有效的CyHV-2的DNA疫苗。

通过基因工程生产的多抗原蛋白亚单位联合疫苗可以防治因病毒突变而导致的免疫逃逸，免疫保护效果好。目前基因工程疫苗绝大多数是通过大肠杆菌表达系统生产，尽管大肠杆菌表达系统表达外源蛋白技术相对较成熟，但获取大量的纯重组蛋白仍存在缺陷。另外由于大肠杆菌不具有翻译后的修饰系统，往往导致重组蛋白的免疫原性较差、且细胞周质中含有种类繁多的内毒素。因此，有必要寻找新的表达系统。

免疫的剂型不仅影响免疫效果，也影响免疫保护期。已有研究表明，海藻酸钠载药微球作为新型缓控释制剂，可增强抗原的免疫活性。但海藻酸钠抗原微球的制备工艺较复杂，影响因素较多；质型多角体是昆虫质型多角体病毒在感染细胞内形成的一种包埋有病毒粒子的蛋白质多面体结晶。

因此，通过杆状表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体有可能作为良好的疫苗，但到目前为止，还没有相关研究报道。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法；用质型多角体蛋白包裹的抗原稳定性好，不易被降解；纯化包裹在质型多角体内的抗原蛋白的方法简便；无核酸污染，生物安全性较高。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，包括下列步骤：

（1）将家蚕质型多角体病毒多角体蛋白基因克隆进pFastBacDual质粒的EcoRI 和XbaI之间，构建重组转移pFastBacDual-polh质粒；

（2）合成融合DNA序列；所述融合DNA序列如SEQ ID NO:3所示；