[发明专利]基于HRM技术检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒及引物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，具体涉及一种基于HRM技术检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒及其引物、应用。

背景技术

结核病是当今全球范围对人类最具有威胁性的感染性疾病之一，而耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB)以及广泛耐药结核病(extensive drug resistant tuberculosis,XDR-TB)的出现使得结核病的流行态势更为严峻。WHO2008报道显示，全球结核病总耐药率为20.0％，耐多药率为5.3％，每年新出现耐多药结核病患者约50万人，广泛耐药结核病患者5万人。随着世界范围内人口流动的增加，耐药性结核病例过去20年来一直呈上升态势，严重地威胁着结核病控制工作的进展。

链霉素、异烟肼和乙胺丁醇属于世界卫生组织推荐的抗结核一线药物，对结核病的治疗具有非常重要的作用，及时进行结核分枝杆菌对链霉素、异烟肼和乙胺丁醇的耐药性检测可指导临床用药，避免延误治疗。结核分枝杆菌对抗结核化疗药物异烟肼(INH)的耐药机制较为复杂，约92％的INH耐药菌与katG，inhA和ahpC三个基因突变有关,其中katG和inhA基因是主要的耐药基因,katG的丢失或突变导致其编码的过氧化氢-过氧化物酶活性丧失或下降，而inhA基因突变减弱了异烟肼对分枝杆菌酸生物合成的抑制作用；结核分枝杆菌耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因，embABC操纵子突变或emb蛋白表达增高有关，该操纵子由embC、embA和embB三个基因组成，其中embB基因(尤其是306位密码子)突变是耐乙胺丁醇产生的主要分子机制；链霉素耐药是由于其核糖体S12蛋白编码基因rpsL或16SrRNA编码基因rr8突变所致，80％耐链霉素结核分枝杆菌临床分离株可见rpsL突变。

结核分枝杆菌的临床检测一直以来主要依靠药物药敏试验，但传统的在固体培养基上进行的药物敏感试验周期长、敏感性低，严重影响了患者的早期诊断和治疗。基因芯片样本的制备和标记较繁琐，仪器昂贵，检测成本高。PCR-限制性片断长度多态性分析只能分析已知序列特异位点的基因突变。快速培养仪检测系统仪器和试剂依赖进口费用高昂。

高分辨溶解曲线(High Resolution Melting，HRM)技术是一种新兴的检测技术，HRM技术是在常规聚合酶链式反应(PCR)过程中饱和荧光染枓如Eva Green与DNA双链结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上便可判断是否存在突变或SNP。不同位点、杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形，所以HRM分析能够有效区分不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。其操作方法简便，样品经PCR扩增后直接进行HRM，PCR产物无需转入其它分析装置，可直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管式操作，不会产生气溶胶污染。是一种可以快速、准确、操作简便、灵敏度高和避免交叉污染的检测技术。

发明内容

为此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中结核分枝杆菌耐药性检测周期长、敏感度低的问题，从而提供一种基于HRM技术快速准确检测结核分枝杆菌多重耐药性的试剂盒，以准确可靠、快速、简便地检测结核杆菌耐药性及多重耐药性。

本发明提供了一种基于HRM技术检测结核分枝杆菌耐药性基因突变的引物组，所述引物组包含至少一种选自以下的引物组：

引物组1：包含碱基序列如SEQ NO.1所示的引物katG315-F和碱基序列如SEQ NO.2所示的引物katG315-R；

引物组2：包含碱基序列如SEQ NO.3所示的引物inhA94-F和碱基序列如SEQ NO.4所示的引物inhA94-R；

引物组3：包含碱基序列如SEQ NO.5所示的引物rpsL43-F和碱基序列如SEQ NO.6所示的引物rpsL43-R；

引物组4：包含碱基序列如SEQ NO.7所示的引物embB330-F和碱基序列如SEQ NO.8所示的引物embB330-R；

引物组5：包含碱基序列如SEQ NO.9所示的引物embB630-F和碱基序列如SEQ NO.10所示的引物embB630-R。

所述引物组特异性识别结核分枝杆菌耐药性基因包括katG基因、inhA基因、rpsL基因和embB基因。