[发明专利]基于高通量测序的PCR产物大样本量混合建库的文库构建方法和试剂有效
| 申请号： | 201710107944.2 | 申请日： | 2017-02-27 |
| 公开（公告）号： | CN108504651B | 公开（公告）日： | 2020-09-08 |
| 发明（设计）人： | 陈建国;陈川;张静;王瑢;杨传春;张文勇 | 申请（专利权）人： | 深圳乐土生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 深圳鼎合诚知识产权代理有限公司 44281 | 代理人： | 孙银行;彭家恩 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市大*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 通量 pcr 产物 样本 混合 文库 构建 方法 试剂 | ||
1.一种基于高通量测序的PCR产物大样本量混合建库的文库构建方法，其特征在于，包括：
(1)将来源于不同样本DNA的多个PCR产物中的每一个，分别与带有标签序列的随机引物进行退火，并在恒温扩增酶的作用下进行恒温扩增反应，得到能够区分样本来源的恒温扩增产物，其中所述带有标签序列的随机引物的序列结构如下：
X(m)N(n)，其中X(m)表示标签序列，其长度为4～15个碱基，用于区分样本来源；N(n)表示随机碱基序列，其长度为6～10个碱基，用于与所述PCR产物随机结合；
(2)将不同样本来源的恒温扩增产物混合，并对混合产物进行片段选择；
(3)对所述片段选择的产物进行5’磷酸化平末端修复和3’末端加A反应，以得到具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段；
(4)将所述DNA片段与接头序列连接，以得到能够区分文库信息的连接产物，其中所述接头序列含有用于区分文库的条形码序列；
(5)对所述连接产物进行PCR扩增，以得到适用于高通量测序的上机文库。
2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述标签序列X(m)长度为6个碱基，所述随机碱基序列N(n)长度为6个碱基。
3.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR产物是目标区域特异性PCR产物。
4.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR产物是单重或者多重PCR反应的产物，其长度大于400bp。
5.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR产物的量是10-50ng。
6.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述标签序列X(m)选自如下标签01至标签48所示的序列中任意一个：
名称 序列 名称 序列 标签01 ACAGTG 标签25 CTATAC 标签02 ACTGAT 标签26 CTCAGA 标签03 ACTTGA 标签27 CTTGTA 标签04 AGTCAA 标签28 GACGAC 标签05 AGTTCC 标签29 GAGTGG 标签06 ATCACG 标签30 GATCAG 标签07 ATGAGC 标签31 GCCAAT 标签08 ATGTCA 标签32 GGCTAC 标签09 ATTCCT 标签33 GGTAGC 标签10 CAAAAG 标签34 GTAGAG 标签11 CAACTA 标签35 GTCCGC 标签12 CACCGG 标签36 GTGAAA 标签13 CACGAT 标签37 GTGGCC 标签14 CACTCA 标签38 GTTTCG 标签15 CAGATC 标签39 TAATCG 标签16 CAGGCG 标签40 TACAGC 标签17 CATGGC 标签41 TAGCTT 标签18 CATTTT 标签42 TATAAT 标签19 CCAACA 标签43 TCATTC 标签20 CCGTCC 标签44 TCCCGA 标签21 CGATGT 标签45 TCGAAG 标签22 CGGAAT 标签46 TCGGCA 标签23 CGTACG 标签47 TGACCA 标签24 CTAGCT 标签48 TTAGGC
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