[发明专利]过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及构建方法

权利要求书

1.过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA，其特征在于利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，所述酶磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2.过表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1，其特征在于利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

3.一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于以得到的pgcA基因和gtaB1基因片段为模版，利用重叠延伸PCR扩增得到pgcA-gtaB1串联基因片段，利用重组酶(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit)将pgcA-gtaB1串联基因片段与表达载体连接，得到重组的串联基因表达载体，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中，通过抗性筛选获得一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌；所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。

4.如权利要求3所述一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体为游离载体，表达载体为PHY300PLK-PamyL-TTamyL。

5.如权利要求4所述一株同时过表达磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。

6.如权利要求3所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计PCR引物扩增磷酸葡萄糖变位酶基因pgcA和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1；

2)利用pgcA基因的上游引物和gtaB1基因的下游引物，以基因片段pgcA和gtaB1作为DNA模板，进行重叠延伸PCR得到pgcA-gtaB1串联基因片段；

3)表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL分别用限制性内切酶Kpn I和Spe I双酶切，其后与pgcA-gtaB1串联基因片段混合，加入重组酶(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit)50℃反应15min，使基因片段与表达载体发生连接，得到PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒；

4)将PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒导入到E.coli DH5α中，以备扩增后电转化；

5)将经提取、浓缩后的PHY300-pgcA-gtaB1过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；

6)转化子经质粒提取后，利用PCR进行验证并测序，从而获得过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-5。

7.如权利要求3所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌在制备多糖絮凝剂中应用。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于所述过表达磷酸葡萄糖变位酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌制备多糖絮凝剂的具体方法包括以下步骤：

1)刮一环地衣芽孢杆菌重组菌HN301-5接种于液体种子培养基中，35～37℃，200r/min培养12～16h，制备种子培养液；

2)按体积比，以4％的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，在30～40℃，150～300r/min条件下培养50～60h，进行发酵产多糖絮凝剂实验；

3)将所得发酵液离心收集上清液，将所得上清液用乙醇法沉淀，沉淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。