[发明专利]采用De novo转录组分析鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法

说明书

本发明公开了一种通过De novo转录组测序，转录本拼接和差异表达分析，鉴定蔻氏隐甲藻中与二十二碳六烯酸(DHA)生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因的方法。具体步骤包括：(1)对隐甲藻进行DHA发酵培养；(2)收集不同生长和DHA积累阶段的菌体并进行RNA提取与转录组Illumina深度测序；(3)测序数据的分析与预处理；(4)对拼接后的转录组进行功能注释与相关性统计分析，鉴定发现隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶，并获得其基因全长序列；(5)通过qRT‑PCR分析技术，对隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶的基因进行表达验证。发明为研究隐甲藻DHA的生物合成机制以及提高隐甲藻中DHA合能力成提供重要的方法和知识基础。

技术领域

本发明属于生物食品领域，涉及一种鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法及其应用。

背景技术

DHA即二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)是人脑发育、成长的重要物质之一，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50％。因此，它对胎儿和婴幼儿的大脑和视网膜的发育，以及成年人脑功能的维修等方面有着重要的作用。此外，DHA对冠心病、中风、高血压等心血管系统的疾病、神经失常、老年痴呆症和抑郁症等神经系统的疾病也有积极的影响。DHA作为一种必需脂肪酸，其增强记忆与思维能力、提高智力等作用更为显著。人群流行病学研究发现，体内DHA含量高的人的心理承受力较强，智力发育指数也高。DHA还可用于癌症治疗，抑制发炎等。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25-26.2亿美元，并且以每年15％以上的速度增长。截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。

微藻中寇氏隐甲藻由于其快速的生长速率及较高的DHA含量、几乎不含其它不饱和多脂肪酸等副产物、易于在实验室条件下大规模培养等优势，近年来在生产中的应用越来越广泛，相关的研究也越来越深入，并逐渐可以替代传统的从鱼类产品中直接提取DHA的方法。隐甲藻作为一种原始的真核单细胞微藻，其生长周期可粗划分为细胞生长阶段和稳定时期，其中稳定期是隐甲藻积累DHA的主要阶段。然而，目前隐甲藻的基因组信息尚未公布，其DHA的合成途径尚不明确，限制了工程改造寇氏隐甲藻的各种努力。在这种情况下，Denovo转录组，又称为从头测序应运而生。该方法不需要任何现有基因组信息，就可以对某个物种的全部转录本进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的全部转录本的序列信息以及不同条件下表达响应过程。因此，利用De novo转录组来解析隐甲藻中DHA的生物合成途径，特别是脂肪酸去饱和催化机制，对进一步提高隐甲藻中DHA含量具有重要指导意义。

发明内容

本发明的目的是利用二代测序技术illumina/solexa系统，对寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)转录组进行de novo深度测序。对测序结果进行生物信息学分析后，得到该物种转录组中全部与DHA合成相关的基因序列(全长或部分)。最终鉴定出DHA积累期在转录组水平表达量显著变化的、和DHA生物合成相关的功能基因。

其过程主要包括如下步骤：

(1)对隐甲藻进行DHA合成的发酵培养：