[发明专利]基于切除修复由酶介导的两步串联信号放大检测UDG活性的方法

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断为目的的基于切除修复由酶介导的两步串联信号放大检测UDG活性的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将UDG作用底物加入到切除反应缓冲液中，进行切除修复反应，将UDG作用底物上的尿嘧啶碱基切除，留下一个脱碱基位点；

(2)将切除修复反应产物加入到扩增反应缓冲液中，进行酶辅助两步串联信号放大反应，即引发链置换反应和指数扩增反应，循环产生增强的荧光信号，通过荧光信号的强弱测定UDG的活性；

所述UDG作用底物为发夹探针结构，所述发夹探针的茎部5′端有一个尿嘧啶碱基，其与互补链上的腺嘌呤互补配对；其环部上有一个切刻内切酶的识别位点；

所述扩增反应缓冲液中，包含：BstDNA聚合酶、限制性核酸内切酶、指数扩增模板、信号探针、核糖核酸酶H、NEB缓冲液、ThermoPol缓冲液和核糖核酸酶H缓冲液；

所述切除反应缓冲液包含待检测的尿嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV和NEB缓冲液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，切除修复反应的条件为：37℃下孵育30-50分钟。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，孵育时间为40分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，酶辅助两步串联信号放大反应的条件为：37℃下孵育60-80分钟。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，孵育时间为70分钟。

6.一种检测UDG活性的试剂盒，其特征在于，包括：发夹探针、信号探针、指数扩增模板、BstDNA聚合酶、限制性核酸内切酶、核糖核酸酶H、NEB缓冲液、核酸内切酶IV、ThermoPol缓冲液和核糖核酸酶H缓冲液；所述发夹探针的茎部5′端有一个尿嘧啶碱基，其与互补链上的腺嘌呤互补配对；其环部上有一个切刻内切酶的识别位点；所述信号探针为两端修饰有荧光分子和淬灭分子的RNA。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述发夹探针的序列如SEQ ID NO.1所示；所述信号探针的序列如SEQ ID NO.2所示；所述指数扩增的序列如SEQ ID NO.3所示。

8.权利要求6-7任一项所述的试剂盒在非疾病诊断为目的检测UDG活性中的应用。