[发明专利]一种东风螺致病性弧菌的快速显色培养基及利用该培养基的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水生致病性弧菌检测技术领域，具体涉及一种东风螺致病性弧菌的快速显色培养基及利用该培养基的检测方法。

背景技术

弧菌病是威胁重要贝类品种——东风螺的重要疾病。自2006年起，多个沿海地区养殖的东风螺频频出现多种病征如“肿吻”、“翻背”、“脱壳”等，导致其大量死亡，造成严重的经济损失。经反复研究和鉴定，发现以上多种病症的病原均是弧菌，主要包括哈维弧菌(Vibrio harveyi)和塔氏弧菌(V.tubiashii)。这2种弧菌也是近年来贝类养殖中出现频率最高的致病菌种类。由各种弧菌引起的东风螺弧菌病的病程较长，死亡率高达50％～60％。研究发现，东风螺在夏季易发东风螺弧菌病，特别是连续高温时，发现其发病频繁且持续时间长，而不同年份发病的时间未显示明显规律性。为了进一步深入研究东风螺弧菌病，需要对其病原体进行进一步的鉴定。

现有的病原菌的鉴定方法主要包括传统检测方法、分子生物学方法、免疫学检测方法等；但这些方法多数难以进行快速估算病原菌的数量，且难以在短时间内获得病原菌种资源并与其它弧菌迅速区分，非常不利于及时地对症治疗。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种东风螺致病性弧菌的快速显色培养基，该显色培养基能针对东风螺致病性弧菌进行快速判别和分离培养。

本发明的第二个目的在于提供一种利用本发明的快速显色培养基进行东风螺致病性弧菌的检测和估数的方法，该方法特异性强、灵敏度高、耗时短、成本低。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种东风螺致病性弧菌的快速显色培养基，其特征在于：每1000mL东风螺致病性弧菌的快速显色培养基中含有蛋白胨10～15g、牛肉膏3～5g、蔗糖10～15g、氯化钠15～25g、青霉素0.05～0.07g、链霉素1～2mg、克林霉素1～2mg、四环素0.025～0.05mg、利福平0.05～0.08mg、苯酚红0.025～0.05g，最终pH为8.0～8.2。

优选地，每1000mL所述的东风螺致病性弧菌的快速显色培养基含有蛋白胨10～12g、牛肉膏3～4g、蔗糖10～12g、氯化钠20～22g、青霉素0.05～0.06g、链霉素1～1.5mg、克林霉素1～1.5mg、四环素0.025～0.03mg、利福平0.05～0.06mg、苯酚红0.02～0.03g，蒸馏水1000mL定容，最终pH为8.0～8.2。

更优选地，每1000mL所述的东风螺致病性弧菌的快速显色培养基含有：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、蔗糖10.0g、氯化钠20.0g、青霉素0.05g、链霉素1mg、克林霉素1mg、四环素0.025mg、利福平0.05mg、苯酚红0.025g，蒸馏水1000mL定容，最终pH为8.2。

经研究发现，本发明中的快速显色培养基的营养组成比例、盐度、pH值等均非常利于东风螺致病性弧菌的快速生长。利用东风螺致病性病原类群对一定浓度下的青霉素、链霉素、克林霉素、四环素、利福平具抗性的特点，本培养基中添加了前述的几种抗生素，以完全抑制其它非致病性的弧菌种类的生长，进而能够有效地将东风螺致病性弧菌从其它细菌，包括对东风螺不具致病性的其它弧菌中区分出来。通过苯酚红的显色时间，可以初步评估东风螺致病性弧菌的数量级。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种利用上述的快速显色培养基进行东风螺致病性弧菌的检测和估数的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备快速显色培养基：按上述的用量关系，取蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、氯化钠和苯酚红溶于蒸馏水中，调节pH值后，高压灭菌并冷却；根据上述的用量关系，再向冷却后的混合物中依次加入青霉素、链霉素、克林霉素、四环素和利福平，使用蒸馏水定容后低温保存待用；

(2)建立东风螺致病性弧菌显色时间表：取步骤(1)的显色培养基，加入东风螺致病性弧菌，配制成东风螺致病性弧菌浓度梯度范围为10⁵～10⁷CFU/mL的显色反应液，封口后培养并进行显色反应，东风螺致病性弧菌置于上述显色培养基中显示黄色，根据不同浓度的东风螺致病性弧菌显色反应液完全显色为黄色的显示时间，建立显色时间表如下：