[发明专利]用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于虾黄头病病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法。

背景技术

黄头病(Yellow Head Disease，YHD)是由黄头病毒(Yellow Head Virus，YHV)引起的对虾传染性疾病，黄头病毒属于套式病毒目(Nidovirales)杆套病毒科(Roniviridae)头甲病毒属(Okavirus)的单链RNA病毒，因濒死虾头胸部因肝胰腺发黄而变成黄色，被称为黄头病。黄头病毒传染率很高，且从对虾感染到死亡经历的时间只有几天时间，给水产养殖人员带来了巨大的经济损失。1992年，泰国因对虾感染了黄头病毒导致减产五千吨，经济损失重大。该病在感染初期的2～4天时会出现不正常的大量进食的现象,而后几乎完全停止进食,接下来便会发现有大量垂死的虾只会聚集在养殖池的池水表面或池塘周围，在严重发病时可使全池的虾在3天内基本全部死亡，死亡率很高。我国将其列为二类疫病，世界动物卫生组织(Office International des Epizooties，OIE)将其列为必须申报的疫病。已知的黄头病毒群有六种，分为YHV(YHV-1型)、鳃联病毒(Gill-associated virus，GAV)(YHV-2型)及其它4种基因型(YHV-3型–YHV-6型)。其中YHV-3型–YHV-6型常见于东非、亚洲和澳大利亚的健康的斑节对虾，表现为极少或从不引发疾病。YHV可以在海水中存活三天以上，在60℃下15分钟可以将其灭活。至今为止，国内外对于YHV的检测方法目前并不多，其中分子学检测方法主要为液相基因芯片法和RT-PCR法，OIE《水生动物诊断手册》(OIE，2012)推荐的为RT-PCR法，但需要后续的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大。而实时荧光RT-PCR技术的发展，使病毒检测技术得到了进一步提高，这种检测技术也被应用到IHNV、VHSV和SVCV的检测中。实时荧光RT-PCR技术进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测，但TaqMan荧光RT-PCR由于使用的荧光探针，其成本较普通PCR高。

综上所述，现有的虾黄头病病毒的检测方法存在步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大，成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，旨在解决现有的虾黄头病病毒的检测方法存在步骤繁琐，耗时也较长，工作量较大，成本较高的问题。

本发明是这样实现的，一种用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物，所述用于检测虾黄头病病毒的荧光引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

本发明的另一目的在于提供一种所述的用于检测虾黄头病病毒的荧光LAMP引物的设计方法，所述设计方法包括以下步骤：

按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中下载YHV基因组序列，进行多序列比对，寻找YHV的一段保守基因作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMP Designer1.1.4设计引物；采用HPLC纯化方式；合成后的引物用DEPC水稀释成100μmol/L溶液，-20℃保存备用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于检测虾黄头病毒荧光LAMP引物的用于检测虾黄头病毒的检测方法，所述用于检测虾黄头病毒的检测方法包括以下步骤：

步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit(200)说明书提取样品核酸；

步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL，RNA模版2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；

步骤三，仪器检测：对反应置于60℃至65℃的反应环境中并以1℃递增进行优化，从多次重复试验中确定最佳反应温度；在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃1min，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。