[发明专利]一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒，负相富集步骤包括：(1)使用前处理液对血液样本进行离心处理，去除血液中部分杂质；(2)使用裂解液对经过步骤(1)的样本进行裂解，去除血液中红细胞，收集剩余细胞；(3)在剩余细胞中加入连接有相应抗体的磁微粒结合白细胞，室温下进行免疫反应；(4)使用分离介质对经过步骤(3)的样本进行分离，去除未结合的磁微粒；(5)使用免疫磁微粒捕获仪，利用微流控技术进行分离，对白细胞进行去除，最后得到富集后的样本。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明对红细胞进行裂解并优化结合了免疫磁分离、密度梯度离心，微流控等多种技术对白细胞进行快速去除，对白细胞的去除率达到了99％以上。

技术领域

本发明属于细胞富集领域，特别涉及一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒。

背景技术

CTC(Circulating Tmor Cells)被定义为自发或因诊疗操作而脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。自2003年，美国德州大学Anderson肿瘤中心的克里斯托弗尼Cristofanilli教授及其团队在新英格兰医学杂志上发表的文献中，首次证实治疗前的CTC数量可作为转移性乳腺癌患者无进展生存率(PFS)和总生存率(OS)的独立预测因子后，有关CTC的检测也已经逐步在科研和临床领域得到了推广和应用。在针对CTC的检测中依据原理主要分为正向与负向。正向主要通过特异性捕捉血液中的CTC细胞来进行相关检测，负向则主要通过特异性的去除血液中已知的除CTC之外的生物标志物(蛋白，细胞，核酸)，从而从全血样本中富集CTCs，而CTC在血液中的存在数量要远远少于血液中的其它细胞，去除CTC之外的细胞会减少对CTC的干扰，提高检测的灵敏度与特异性，故在CTC检测之前如何去除无关检测的杂质也是一个重要的研究方向。

CD系列抗原为人白细胞分化抗原，其中CD45由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面；CD45在所有白细胞中均呈高表达，称为白细胞共同抗原。现在常规的白细胞去除主要通过离心、免疫等方式，使用免疫原理去除也有使用亲和层析、磁微粒等多种不同手段，但是所使用的免疫抗体通常只有单独的抗CD-45抗体，虽然抗CD-45抗体是现有CD系列抗体中与白细胞结合率最高的抗体，但结果依然有可提升的空间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒，该方法对红细胞进行裂解并优化结合了免疫磁分离、密度梯度离心、微流控等多种技术对白细胞进行去除，对白细胞的去除率达到了99％以上。

本发明提供了一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法，包括：

(1)使用前处理液对血液样本进行离心处理，去除血液中部分杂质；

(2)使用裂解液对经过步骤(1)的样本进行裂解，去除血液中红细胞，收集剩余细胞；

(3)在剩余细胞中加入连接有相应抗体的磁微粒结合白细胞，室温下进行免疫反应；

(4)使用分离介质对经过步骤(3)的样本进行分离，去除未结合的磁微粒；

(5)使用免疫磁微粒捕获仪，利用微流控技术进行分离，对白细胞进行去除，最后得到富集后的样本。

所述步骤(1)中的前处理液的组成为每升80.00g氯化钠，2.00g氯化钾，14.20g磷酸氢二钠，2.77g磷酸二氢钾，3.72g乙二胺四乙酸二钠，50.00g小牛血清白蛋白，5.00mlTween-20，20.00g蔗糖，0.5ml Proclin-300。

所述步骤(2)中的裂解液的组成为每升32.094g氯化铵，10.00g碳酸氢钾，0.372g乙二胺四乙酸二钠，0.5mlProclin-300。