[发明专利]一种数字PCR芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种数字PCR芯片及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)提出以来，核酸体外扩增和定量技术已发展成为分子生物学领域的一项核心技术。目前，以PCR为基础的核酸定量检测技术，因其分析速度快、灵敏度高、高通量及诊断时间短的显著优点，成为疾病早期诊断的主要应用技术，并广泛应用于分子测序、基因表达分析、基因突变研究和药物筛选等其他研究领域。

美国ABI公司推出实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技术及相关产品，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环产物量的变化，通过循环阈值(cycle threshold,C_t)和标准曲线对起始模板进行定量分析，将PCR由定性与半定量的体外合成技术发展成为高灵敏度、高特异性的，可对核酸进行相对定量的基因分析技术。发展至今，qPCR已经成为应用最多、灵敏度最高的核酸定量技术，其准确度可达95％，但是，由于qPCR是一种核酸相对定量技术，对低倍差异的分辨能力不足，另外对于含量低于1％的微量突变的检测无能为力。

Vogeldtein和Kinzler提出了一种新的核酸定量技术——数字PCR(D-PCR)技术，该技术的原理是将一个样本稀释成几十到几万份，分配到不同的反应单元，使每个单元至多包含一个拷贝的目标分子(初始DNA模板)，在每个反应单元中进行单个拷贝DNA的PCR扩增，扩增结束后，对有荧光信号的单元进行计数，计数结果即为初始DNA模板的拷贝数。

根据数字PCR的原理，从实现途径上，数字PCR技术包括三个步骤：样品分散、PCR热循环、结果检测分析这三个环节。其中样品分散成大量均一的微单元是关键步骤，是dPCR技术检测敏感性以及绝对定量准确性的关键。根据样品分散方式的不同，现有的数字PCR技术可分为微流控芯片数字PCR技术和液滴数字PCR技术。

已经得到实际应用的微流控芯片数字PCR技术包括Fluidigm公司推出的BioMark^TMcdPCR系统、Life公司推出的QuantStudio 3D cdPCR系统和Bio-Rad公司推出QX200^TMddPCR，这些系统分散能力有限，仅仅将10μL的PCR预混液分解成20000个液滴以内的液滴。

现有的液滴数字PCR技术包括Raindance公司推出RainDrop ddPCR系统。该系统通过单拷贝DNA和PCR反应需要的一些试剂包裹在一个液滴中，然后进行完整的PCR循环。该系统可将液滴分散成百万级的液滴，但是，该系统采用流式分析技术在流式细胞仪中对百万个液滴逐个进行分析，信号读取耗费时间长，导致检测周期长，整个检测过程时长可达3.5小时。此外，由于液滴需要转移至流式细胞仪中进行分析，转移过程很难避免污染和破乳的发生。另外，该系统产生液滴后收集进行PCR反应时，不是单层液滴排布，而是收集进一个样品槽内，会导致部分液滴融合，从而导致该系统液滴的均一性不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种数字PCR芯片及其制备方法，使得所提供的芯片在进行D-PCR检测时液滴信号读取速度快，检测周期短，避免污染和破乳，反应稳定，均一性高，密封良好。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种数字PCR芯片，其特征在于，包括液滴产生模块和与该液滴产生模块一面紧贴的液滴收集模块，其中液滴产生模块由盖片与玻璃基片贴合而成，盖片上具有两个通孔，分别为液相进样口和油相进样口，与玻璃基片相贴合的盖片的一面上刻蚀有与液相进样口或油相进样口连通的微流沟道，两微流沟道分别分岔为两条分沟道，所述分沟道两两相交于液滴产生接口；液滴收集模块包括一个两边开口的腔体，其中开口的宽度不小于两接口的连线长度或距离，且液滴产生接口均紧贴其中一个开口的边缘。

所述盖片和玻璃基片通过不可逆的等离子体键合贴合在一起。

所述液滴产生接口为T字形。

所述液滴收集模块为由模具直接模塑成的腔体，或者为由至少一个由透明、疏水和耐高温材料薄片与玻璃基片粘合而成的腔体。

所述薄片下表面两侧有粘合剂，该粘合剂并与玻璃基片粘合。

所述粘合剂的厚度y与液滴产生模块中产生的液滴直径x的关系为x≤y≤2.5x。

所述薄片的尺寸为1cm×1cm到3cm×3cm。