[发明专利]HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉及其制备和应用

说明书

本发明公开了一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，按质量百分比包括以下组分：人脐带MSC无血清培养液活性蛋白成分5～12％，壳聚糖20～65％，三聚磷酸钠1～15％，透明质酸20～65％，水≤5％。其制备方法为，先采用CS纳米粒制备工艺将具有多种活性细胞因子的干细胞无血清培养上清液包覆，进而冻干，再使CS纳米粒表面的活性氨基与HA表面的羧基发生共价偶联反应，制得本发明产品。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，还涉及了该冻干粉的制备方法。

背景技术

干细胞美容最早是在整形外科中的应用，而整形外科中应用的较多的干细胞种类是间充质干细胞、表皮干细胞、血管内皮祖细胞及前脂肪细胞等。

传统上所谓的干细胞美容术，一般都是直接注射干细胞针剂。而这种注射用干细胞的来源主要是从流产的胚胎中提取的，所以难免会引起免疫排斥反应，而且存在一定的伦理问题。即使是采用自体干细胞，但是在干细胞的培养扩增过程中会引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫排斥反应。

人间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)在培养中分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和肝细胞生长因子(HGF)在内的多种促进皮肤细胞再生的生长因子。这些具有生物活性的生长因子能够有效的促进皮肤细胞的新陈代谢；促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性；促进表皮细胞的生长、分化和修复，使衰老死亡的细胞得以及时补充；同时能够加速角质层修复，加速基底新老细胞更替，使肌肤回到年轻姿态。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，解决液态干细胞培养上清保存期有限这一瓶颈，同时解决干细胞培养上清中细胞生长因子活性保存问题。

本发明的第二个目的是提供上述人脐带MSC无血清细胞培养液CS纳米粒冻干粉的制备方法。

本发明所采用的第一个技术方案是，一种HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉，按质量百分比包括以下组分：人脐带MSC无血清培养液活性蛋白成分5～12％，CS(壳聚糖)20～65％，TPP(三聚磷酸钠)1～15％，HA(透明质酸)20～65％，水≤5％，以上各组分的质量总和是100％。

本发明所采用的第二个技术方案是，上述HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，制备负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒；

将人脐带MSC无血清培养液加入CS酸溶液中，并加入TPP，室温反应。将反应后的纳米粒混悬液离心，所得沉淀洗涤、冷冻干燥，得到负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒。

步骤2，制备HA修饰的负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉；

对HA中的羧基进行活化，然后将负载人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒加入到活化后的HA中反应，取反应后的纳米混悬液，离心，所得沉淀洗涤并冷冻干燥，即得HA修饰的人脐带MSC无血清培养液CS纳米粒冻干粉。

其中，步骤1中人脐带MSC无血清培养液的制备方法为：取新生儿脐带，将静脉内血迹洗涤干净；去除表皮、两条动脉血管及一条静脉血管，将组织剪碎，加入含FBS的DMEM/F12培养基培养，得到原代人脐带间充质干细胞；当细胞融合度为80％-90％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养，取传代细胞，继续培养，当细胞融合度80％-90％时，弃含FBS的培养上清，PBS洗涤细胞，加入无血清的DMEM/F12培养基继续培养72小时，收集无血清培养液。