[发明专利]重组枯草芽孢杆菌串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1－F2蛋白

权利要求书

1.串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1-F2蛋白的重组枯草芽孢杆菌整合表达质粒pInHAPB1，是由以下方法构建而成：

1.1高致病性禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因的克隆；

以含有血凝素的质粒pCI-H5HA(哈尔滨兽医研究所陈化兰惠赠，NCBI编号是AF144305)为模板，设计引物进行PCR扩增。在上游引物引入与GFP末端16bp的同源臂序列；在下游引物引入与PB1-F2末端16bp的同源臂序列。

引物序列如下：

P1：GGCATGGATGAACTATACAAATACCATGCAAACAACTCG

P2：CACTTCCACCTCCACCGCAAATTCTGCATTGTAAC

PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min30sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因序列SEQ ID NO.1。

1.2高致病性禽流感H5N1病毒PB1-F2基因的合成：

参照已发表的H5N1的PB1-F2蛋白基因序列(GenBank登陆号：GU596982)，设计一对扩增PB1-F2蛋白基因的引物，在上游引物引入与HA 3’末端16bp的同源臂序列，在下游引物引入与枯草芽孢杆菌cotG 5’末端16bp的同源臂序列，在下游序列与载体之间引入BamH1酶切位点(下划线为酶切位点)。

引物序列如下：

P3：GTGGAGGTGGAAGTAGGAGGATGGAACAGGAACAGG

P4：GGTACCAAGCTTTTAGGATCCTCCAGTTTATCCACTCTTG

参照已发表的H5N1的PB1-F2蛋白基因序列(GenBank登陆号：GU596982)，将PB1-F2序列送去南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以P3、P4为引物合成的PB1-F2为模板进行PCR扩增增强肠道DC活性的PB1-F2蛋白。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得低致病性禽流感H5N1病毒PB1-F2基因序列SEQ ID NO.2。

1.3融合HA和PB1-F2片段

用重叠PCR将扩增的HA与PB1-F2使用P1，P4引物以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为模板进行PCR扩增获得目的片段HA-PB1-F2。PCR反应反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收获得HA-PB1-F2基因序列SEQ ID NO.3。

1.4绿色荧光蛋白基因GFP的克隆

参照已发表的绿色荧光蛋白基因序列(GenBank登陆号：KU312311.1)设计一对扩增绿色荧光蛋白基因GFP的引物，在上游引物引入与载体基因3’末端16bp的同源臂序列，两序列之间引入Xba1酶切位点(下划线为酶切位点)；在下游引物引入与HA蛋白5’末端16bp的同源臂序列，引物序列如下：

P5：AAGAAATACAAATCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACT

P6：TCGAGTTGTTTGCATGGTATTTGTATAGTTCATCCATGCC

以pINAmyE-CotG-GFPCOE-FimH质粒为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得绿色荧光蛋白基因GFP的基因序列SEQ ID NO.4。

1.5整合表达载体pInHAPB1的构建

将回收的SEQ ID NO.3序列和SEQ ID NO.4序列使用One Step Cloning Kit定点克隆试剂盒克隆至载体骨架pInAmyE-CotG(Xba1和BamH1酶切后pINAmyE-CotG-GFPCOE-FimH胶回收获得)。测序后获得整合表达载体pInHAPB1。