[发明专利]一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法

说明书

本发明公开了一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，该方法基于SNP位点之间的差异，设计对应的引物进行扩增后进行检测，可同时对两个SNP位点进行焦磷酸测序。本发明提供的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法可以同时检测两个SNP位点，随机成功率高，节约了一倍的人力物力，且结果可视化、准确率高，降低了检测成本，满足了临床上双位点同时检测的需要，也为未来多位点的焦磷酸测序检测SNP检测奠定了理论基础，具有良好的推广价值。

技术领域

本发明涉及一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，属于单核苷酸多态性检测领域。

背景技术

单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是最为常见的一种遗传多态性，占所有已知多态性的的90％以上。现有公共数据库中已经报道了超过900万个SNP位点。开展SNP研究对遗传学、医学、药物开发与合理用药、临床诊断、法医学的发展均具有十分重要的意义。作为第三代遗传标记，SNP具有稳定遗传、高密度、容易规模化和自动化分析等前两代遗传标记无可比拟的优点。SNP分型检测工作，已成为当前国际上研究的热点。近年来，SNP检测方法和相关仪器的研发进展很快。目前，进行SNP分型检测的基本方法已达20余种。各种SNP分型检测方法可看成由等位基因特异性识别的原理方法和等位基因识别产物的分析检测两部分组成。等位基因特异性识别原理有引物延伸反应原理、序列杂交反应原理、酶连接反应原理、酶切割反应原理等；等位基因分析检测手段有质谱、荧光共振和偏振信号检测、化学发光检测、生物传感器检测等。为了提高方法的特异性和灵敏度，绝大多数的基因分型方法都需要对目标检测序列片段进行PCR扩增从而增加检测靶标分子的数目。等位基因识别反应在溶液中更为稳定，但在固相载体上捕获反应产物能够使大量检测平行进行，从而极大提高分析的通量。虽然两个部分操作可以在一定的条件下同时进行，但是为了提高检测的精确性和灵敏度，大多数的分型方法都将两个操作过程分离进行。

焦磷酸测序(preosequencing)技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。是一个理想的遗传分析技术平台，既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等，该项技术目前已被广泛应用于医学生物等各个领域。

焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine 5’phosphosulfate，APS)和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化ASP和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由Pyrogram^TM转化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。在实验过程中用α-硫化的三磷酸腺苷(dATPαS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利用，而不被虫荧光素识别。由于SpdATPαS可以降低dATPαS降解产物的浓度，近年来，单链DNA结合蛋白(single starnd DNA binding portein，SSBP)和纯化SpisomerdATPaS的使用dATPαS降解产物抑制双磷酸酶活性的这一问题得到较好解决，使得测序长度可达10bp，拓展了该技术在遗传学领域的应用范围。