[发明专利]一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程关节软骨损伤修复治疗领域，具体来说是一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法。

背景技术

关节软骨缺损在临床较为常见，目前治疗关节软骨缺损的主要方法均有明显缺陷,软骨损伤目前的治疗方法包括软骨成形术、骨髓刺激技术（即微裂缝），自体骨软骨移植、自体软骨细胞移植疗法等。

骨髓刺激技术临床上一般用于年轻患者较小的病变，其也显示出巨大的成功,自体骨软骨移植通常是用于给患者较小的病变,骨软骨移植也被用于较大的软骨损伤的治疗，但这种技术的使用受移植物来源的限制，造成供体部位的额外损伤，修复后过度生长，骨膜增生，同时有疾病传播的风险。

第一代的细胞疗法即自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI），将自体软骨细胞悬液注入缺损中以修复损伤。大量的研究表明，ACI技术可显著改善运动功能，减轻症状，产生透明样软骨。但是这种技术需取健康的骨膜缝合固定，对健康组织产生影响，且技术复杂，手术时间长，存在修复后过度生长，骨膜增生，骨膜脱落，细胞流失等风险，限制了这种技术的应用。第二代细胞疗法采用一种可吸收的胶原膜覆盖软骨缺损，替代自体健康骨膜组织，这种技术与第一代的细胞疗法具有类似的疗效，减少了对健康组织的损害。但其仍需两次手术，仍需缝合，技术相对复杂，细胞分布不均衡，存在细胞流失的风险。

第三代细胞疗法将培养的自体软骨细胞种植在可吸收的胶原膜上，通过纤维蛋白胶固定于损伤处,无需缝合，手术时间显著缩短，疗效显著，不受损伤面积的限制，临床效果持久，克服了第一、第二代ACI技术的缺点。但是仍需二次手术，治疗费用高昂。

另一方面，随着组织工程技术的发展，干细胞技术日益成熟，其在医学上应用也越来越被关注,由于干细胞具有组织全能性，能分化成各种组织细胞，尤其是可分化成软骨细胞，这使其在临床上应用于修复软骨损伤成为可能。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的治疗效果差、成本高的缺陷，提供一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法来解决上述问题。

本发明公开了一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法，具体步骤为：

（1）、在无菌条件下，用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去针头后，加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混匀后得到骨髓悬液，备用；

（2）、在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封带入实验室中，然后将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再对上清离心30min，去沉淀，0.22 μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；

（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，进行梯度离心，即在2000rpm的条件下，离心20min；

（4）、 吸取中间白膜层，再加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min， 弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；

（5）、向DMEM高糖培养基中加入FGF-2、自体血清、庆大霉素，直至DMEM高糖培养基中的FGF-2的质量浓度为10 ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，然后将目的细胞加入15ml含10 ng/ml FGF-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的DMEM高糖培养基中，吹打计数，以5×10⁵/cm²接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的CO₂培养箱中培养，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基同样含10 ng/ml FGF-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml；

（6）、细胞贴壁达到90%以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；

（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶- EDTA 溶液，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的CO₂温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入3-5ml高糖DMEM培养基终止消化；