[发明专利]一种用于表观遗传分析的设备和方法

权利要求书

1.一种用于表观遗传分析的设备，包括箱体(1)，其特征在于：所述箱体(1)的内腔设置有通道(2)，所述通道(2)的内腔顶部设置有光源装置(3)，所述通道(2)的内腔底部设置有接触装置(4)，所述箱体(1)的顶部左右两侧分别设置有控制器(5)和显示屏(6)，所述箱体(1)的左侧设置有激光器(7)，所述控制器(5)分别与光源装置(3)、接触装置(4)、显示屏(6)和激光器(7)电性连接。

2.根据权利要求1所述的一种用于表观遗传分析的设备，其特征在于：所述通道(2)为亚微米通道。

3.根据权利要求1所述的一种用于表观遗传分析的设备，其特征在于：所述激光器(7)的右壁安装有激发滤光器。

4.根据权利要求1所述的一种用于表观遗传分析的设备，其特征在于：所述接触装置(4)为微流控设备。

5.一种用于表观遗传分析的方法，其特征在于：该种用于表观遗传分析的方法步骤如下：

S1：提取染色质样品：挑单菌落，接种于YPD培养基中过夜培养，将YPD培养基置于25-30℃下保存，取一只150mL烧瓶，将过夜培养的菌液稀释至40-60mL,然后将烧瓶在25-30℃下培养，用终浓度为2％的甲醛交联细胞30-40min，加入终浓度为125mM的甘氨酸，反应4-10min，使反应猝熄，收集细胞，用20-30mL的PBS缓冲液清洗菌体1-2次，重悬菌体，取一只15mL的圆锥试管，将菌体重悬于组成的溶液中，加入终浓度为0.20-0.30mg/mL的酵母裂解酶进行震荡，得到原生质体，向原生质体溶液中加入微球菌核酸酶稀释，再加入SDS和EDTA终止反应，在60-70℃过夜保存，再用氯仿抽取DNA，用无水乙醇沉淀DNA，再加入80-100μl的TE溶解DNA，-20℃保存备用；

S2：序列特异性探针标记染色质：先用适量的DNaseI在二价镁离子存在下，在双链染色质上打开单个单链缺口，利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性在切处将旧链从末端逐步切除，同时在DNA聚合酶活性的作用下，顺序将特异性探针连接到切口的末端氢氧基上，以互补的DNA单链为模板合成新的DNA单链；

S3：MBD1标记染色质：将MBD1的甲基化敏感的结合域MBD被克隆到pET-30b质粒，以产生在IPTG诱发下表达的His-tag融合蛋白，溶解IPTG诱发的大肠杆菌，且纯化并在镍柱上再折叠融合蛋白，在纯化之后，使用标记游离胺的微刻度标记试剂盒用Alexa488来标记融合蛋白，进行三次另外的树脂纯化循环以更好地将游离标记纯化掉，用Southwestern槽的印迹来测定所标记的MBD探针的完整性，以50ng/μL悬浮在1x的Tris缓冲盐水中的甲基化的DNA和未甲基化的DNA的混合物中，我们使用TOTO-3来进行DNA染色，然后，将约1μg的经标记的DNA稀释到包含具有2％牛血清蛋白和0.1％TritonX-100(v/v)的1x的TBS的20μL的缓冲液中，然后，将以280ng/μL储存的且用AlexaFluor488标记的1μL的MBD1的容积添加到DNA以便在摩尔过量的条件下进行结合反应；结合反应在室温下发生2-3小时；

S4：染色质样品与通道接触：将样品保持在它们相应的储存缓冲液中，直到DNA标记和MBD结合反应，在这些反应之后，连续地将样品稀释在1x的TBE，89mM的TRIS硼酸盐和2mM的EDTA，最终的稀释将样品悬浮在600pM的估计浓度，标称为对于染色质样品为1-2ng/μL，且对于甲基化的DNA样品为约0.25ng/μL，缓冲液中的聚合物添加剂用于限制电渗流并防止与流控通道壁的非特异性相互作用而不使得蛋白质变性，我们将50μL的样品溶液加载到流控通道阵列的输入储器中，且然后连接到阴极，输出储器仅包含缓冲液溶液，且连接到阳极，对于所有的染色质样品，在偏置电压下，且对于所有的甲基化的DNA样品，在偏置电压下，使得样品在20-30min的预流时间期间建立稳定的电动流动，以确保在数据收集之前已经实现稳态流条件，检查每一种样品达总计15min，总是使用阵列内的相同流控通道，在单分子探测之后，在加载下一个样品之前，反复冲洗流控通道阵列达总计30min，且然后检查以验证荧光标记的分子的消失；

S5：测试与分析：将序列特异性探针标记的染色质和MBD1标记的染色质流过通道(2)，利用光源装置(3)照亮通道(2)以产生多个探询容积，每一个探询容积由通道(2)的壁和光束限制，探测来自多个的相同或不同探询容积的至少一个标记和一个其他标记，以产生至少一个标记和至少一个其他标记的时间相关的分辨率，利用激光器(7)在通道(2)内的溶液中的DNA样品流动、用高斯形状的激光剖面照亮样品和探测表示组蛋白或DNA组分的荧光事件，控制器(5)被编程为提供来自一个或多个探询容积的至少两种类型的信号的实时的时间相关的分辨率，由此表征物体，显示屏(6)其配置成接收来自处理器的数据和显示数据，其中数据包括关于来自一个或多个探询容积的至少两种类型的信号的信息。