[发明专利]一种检测水稻稻曲病菌cyp51基因核苷酸突变位点的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水稻稻曲病菌cyp51基因核苷酸突变位点的方法。属于分子生物学技术领域。

背景技术

水稻稻曲病（False smut of rice）俗称青粉病、黑球病、谷花病，是一种水稻穗部真菌病害，往往都发生在水稻丰收之年，故也被称之为“丰收病”。稻曲病主要发生于成熟期水稻穗部。该病原菌的有性态为（Villosiclava virens）属于子囊菌门子囊菌纲麦角菌属，无性态为（Ustilaginoidea virens）属于半知菌门腔孢纲绿核菌属。80年代以来，随着我国杂交稻、直立型和密穗型高产水稻品种大力推广及农田肥力的提高，稻曲病已从次要病害上升为我国水稻生产上的主要病害，发病的田块每个病穗上的病粒一般为1-10粒，多的会达到30-50粒，病穗率多在5-20%，严重影响了水稻的产量和品质。

长期以来，水稻稻曲病是次要病害，并未引起足够重视，缺乏相应的抗病品种，化学防治仍然是控制稻曲病的主要手段，其中DMIs类杀菌剂中的戊唑醇是防治稻曲病的主要化学药剂。戊唑醇（Tebuconazole）是德国拜耳公司于20世纪90年代末期开发的一种三唑类杀菌剂，含有芳香杂环，属于14-α脱甲基反应抑制剂（14α-de Methylation inhibitors，DMIs）中重要的一类，已在50多个国家和60多种作物上取得登记并广泛应用。与其他DMIs一样，戊唑醇主要是对病原菌细胞膜上的麦角甾醇生物合成起抑制作用，从而对病原菌表现出抑菌作用，对植物则表现出內吸治疗作用。由于戊唑醇的大量使用，田间已有许多植物病原菌对该药剂产生了不同程度的抗性，如葡萄炭疽病菌[陈聃等，2013]（Colletotrichum gloeosporioides）、苹果轮纹病菌[范昆等，2013]（Botryosphaeria dothidea）、龙眼焦腐病菌[Pereira et al, 2012]（Lasiodiplodia theobromae）等都对戊唑醇产生了一定水平的抗药性。

目前，戊唑醇是三唑类杀菌剂中销售额最高的一个药剂，对水稻稻曲病的防治具有重要的意义。本研究室通过药剂驯化的方法得到了对戊唑醇产生中抗水平的水稻稻曲病菌菌株，并且部分抗性菌株的生存适合度较高，表明具有较高的抗性风险。因此，在使用戊唑醇防治水稻稻曲病病害时应避免抗药性的产生，加强检测和早期预警水稻稻曲病菌对戊唑醇的抗性发生发展情况，有助于指导戊唑醇的科学使用，延缓抗药性的发生和发展，延长药剂的使用年限。

传统的抗性检测方法包括：菌丝生长速率法、菌丝干重测定法、孢子萌发测定法等。这些传统的测定方法均需要制备含药的培养基，计算有效抑制中浓度，耗费时间长，工作量大，灵敏度低。随着分子生物学技术的发展，针对单碱基突变引起的抗性，AS-PCR和CAPS方法已成功用于抗性菌株的分子检测，具有检测所需时间短，灵敏度高等优点，因此被用作田间抗药性早期诊断的理想方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测水稻稻曲病菌cyp51基因核苷酸突变位点的方法及其专用引物。

用于检测水稻稻曲病菌cyp51基因核苷酸突变位点的引物，所述引物为: Uv137F1：TTCACTGGTTCCCCTTTATCGG（SEQ ID No.1）；Uv137DR：GGCGTTGGGGCAATCGCG（SEQ ID No.2）。

本发明所提供的检测或辅助检测水稻稻曲病菌cyp51基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测水稻稻曲病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物进行PCR扩增，若能扩增出391 bp条带，则所述待测的水稻稻曲病菌中cyp51基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指水稻稻曲病菌cyp51基因的基因组序列自5’末端起第543位核苷酸为C。

所述cyp51基因的基因组序列自5’末端起第543位核苷酸为SEQ ID No.4中自5’末端起第543位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为51.6℃。

本发明的另一个目的是提供水稻稻曲病菌中cyp51基因或蛋白的突变位点。

本发明所提供的水稻稻曲病菌cyp51基因的一个突变位点，为水稻稻曲病菌中cyp51基因的基因组序列自5’末端起第543位核苷酸为C。所述cyp51基因的基因组序列自5’末端起第543位核苷酸为SEQ ID No. 4中自5’末端起第543位核苷酸。