[发明专利]同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR引物及其检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌属(Klebsiella)，为有荚膜的革兰氏阴性菌，包含肺炎亚种(subsp.pneumoniae)、鼻炎亚种(subsp.azaenae)和鼻硬结亚种(subsp.rhinoscleromatis)3个亚种。肺炎克雷伯氏菌于1882年首次分离出来，是革兰氏阴性菌感染中仅次于大肠杆菌的条件致病菌。它是一种人畜共患致病菌，主要引起人的肺炎、呼吸道疾病、肠炎、败血症等，研究人员陆续从鲤、小鼠、梅花鹿、牛、大熊猫等多种动物上分离发现该菌。由于机体免疫力的降低，抗菌药物的滥用，物种间的交叉感染，肺炎克雷伯氏菌对畜禽、水产动物等的危害越来越严重，引起鲤、白鲢、中华鳖等大规模的感染及发病。

豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)属于气单胞菌属(Aeromonas)，为嗜温有动力气单胞菌(mesophilic motile aeromonas)，普遍存在于淡水、海水、淤泥和污水等环境中，是一种条件致病菌，其宿主范围很广，能引起人类和动物的腹泻。豚鼠气单胞菌单独或与其他病原菌混合感染也能引起多种水产养殖动物如鳗鲡、鲢鳙、金鱼、鲤、对虾等的败血症及甲鱼、中华绒螯蟹等的病害，造成水产动物的大量死亡。

近年来，我国水产养殖动物大规模暴发细菌性败血症引起了研究者的重点关注。经过病原分离鉴定，发现了致病菌肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌。通过对现有资料文献检索发现，目前肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的检测方法主要有:细菌培养法、核酸PCR检测法(TaqMan real-time PCR法和SYBR Green real-time PCR法)和DNA碱基序列测定技术、基因芯片技术、LAMP结合示差脉冲伏安法、PCR-DHPLC检测技术等。这几种方法具有不受病程影响、快速、敏感性和特异性高、新颖的优点，但成本高，实验条件要求高，需要精密昂贵的仪器、操作复杂，不适合在基层进行检测和推广。寻求一种在实际生产中快速、准确、灵敏、特异的检测方法，对于病原的确定及诊治尤为重要。由于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)适合早期和大量样品的检测，且操作简单，耗时短，试验要求不高，能大批量检测样本，具有普遍适用性，能很好的满足水产动物病原菌的检测需求。本试验选择肺炎克雷伯氏菌的毒力外膜蛋白C基因和豚鼠气单胞菌的外膜蛋白Aha1基因，来建立一种双重PCR检测方法，为引起鱼体暴发性出血病病原肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的检测提供可靠、可行的技术支持。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，建立一种同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR方法，该方法可用于肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR检测，具有检测结果特异性强、灵敏度高、实用性强等特点。

按照本发明提供的技术方案，一种同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重PCR引物，引物对如下：

引物ompC：

正向引物F：5’-AACACTGAAA GCTCCAGCGA-3’；

反向引物R：5’-CGTCGGTACG TTTGGAGTGA-3’；

引物ahal：

正向引物F：5’-AGACGGTACC ACTTTCGACG-3’

反向引物R：5’-ATGTGACGCG GGTCTATGTC-3’。

以引物ompC和引物ahal为靶基因，通过双重PCR方法，以待检样品DNA为模板，以引物ompC和引物ahal扩增靶基因，检测是否存在扩增产物，有对应条带则表明检测结果为阳性。

具体步骤如下：

(1)肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的DNA提取：扩大培养肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌，采用常规细菌基因组DNA抽提试剂盒提取肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌菌液的DNA，溶解在pH7.5的TE缓冲液中，置于-20℃保存备用；

(2)双重PCR反应：引物ompC和引物ahal在同一反应体系中同时进行双重PCR反应，其中取浓度均为100mmol/L的上下游引物各0.5-1μL，

(3)电泳检测：取5-10μL PCR检测产物，在1％含goldview染色剂的琼脂糖凝胶上电泳检测，结束后将胶放在凝胶成像系统下观察结果并拍照记录；