[发明专利]生产利妥昔单抗的高表达、高稳定性CHO细胞株及其构建方法

说明书

本发明提供了一种生产利妥昔单抗的高表达、高稳定性CHO细胞株及其构建方法。具体地本发明利用经悬浮驯化的CHO‑K1作为宿主细胞，构建单克隆抗体轻链(Light Chain,LC)pcDNA3‑RX‑Neo和重链(Heavy Chain,HC)pcDNA3‑RX‑GS双表达质粒，稳定转染外源双质粒，经双筛选标记筛选、基因扩增和对基因扩增后细胞系进行筛选，得到了适合无血清悬浮培养的、稳定的、高效表达利妥昔单抗的TRS001细胞株D3G6C11。其产量在1.7‑2.2g/L之间,为大规模产业化制备利妥昔单抗奠定了良好基础。

技术领域

本发明属于生物技术和生物制药领域，特别涉及可以稳定高效分泌表达利妥昔单抗的单克隆抗体的CHO细胞株、其构建方法与应用。

背景技术

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一组起源于淋巴结或其它淋巴组织的恶性肿瘤，惰性淋巴瘤占25％～40％，其比例逐渐上升。惰性淋巴瘤以现有的技术难以治愈，常见的化疗并不能提高患者的生存率。

CD20抗原是一种细胞表面非糖基化疏水磷酸蛋白，位于前B和成熟B淋巴细胞表面，造血干细胞、前前B细胞、正常浆细胞和其他正常组织不表达CD20。95％以上的B细胞性非霍奇淋巴瘤细胞表达CD20。

抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)是针对B细胞CD20抗原的一种人鼠嵌合型单克隆抗体。利妥昔单抗是全球第一个被批准用于临床治疗NHL的单克隆抗体。经中国食品药品监督管理局(SFDA)批准，美罗华可用于：联合CHOP方案8个疗程治疗侵袭性(弥漫大B细胞)淋巴瘤联合CVP方案8个疗程一线治疗惰性(滤泡性)淋巴瘤治疗复发或化疗耐药的惰性B细胞性非霍奇金淋巴瘤。夏忠军等在含美罗华方案治疗B细胞性惰性淋巴瘤34例报告中研究含美罗华方案治疗我国惰性淋巴瘤的疗效和安全性，发现利妥昔单抗单药或联合化疗治疗惰性淋巴瘤具有良好的临床疗效和安全性。国外的原研药价格昂贵，为中国生物类似药的发展提供广阔空间。

常规CHO细胞贴壁生长，需要有牛血清或类似成分的存在，而这些添加物对重组蛋白的表达及后期纯化过程有很大的影响。需要进行无血清驯化，使细胞能在无血清培养基中生长良好，持续分泌重组蛋白且利于下游生产。目前哺乳动物细胞无血清、高密度、大规模悬浮培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一。

利用经悬浮驯化的CHO-K1作为宿主细胞，G418、GS双筛选标记的表达载体多由美国等发达国家开发，其专利保护、技术转让壁垒极大地限制了我国生物制药技术及工业的发展，促进相关蛋白药物的开发对我国生物制药工业具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产利妥昔单抗的高表达、高稳定性CHO细胞株及其构建方法。

本发明的第一方面，提供了一种构建高产利妥昔单抗的细胞株的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供编码利妥昔单抗重链和轻链的核苷酸序列，分别将所述编码利妥昔单抗重链和轻链的核苷酸序列插入到同一pcDNA3.0质粒，从而得到含有编码利妥昔单抗重链和轻链的核苷酸序列的重组质粒pcDNA3-RX-Neo；

(2)提供人源性GS基因核苷酸序列，将所述人源性GS基因核苷酸序列插入所述重组质粒pcDNA3-RX-Neo，从而获得重组质粒pcDNA3-RX-GS；

(3)将所述重组质粒pcDNA3-RX-Neo和所述重组质粒粒pcDNA3-RX-GS共转染至CHO-K1细胞株中，经过筛选从而获得所述高产利妥昔单抗的细胞株。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，包括步骤：