[发明专利]基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法

说明书

技术领域

本发明属于恶性疟原虫检测技术领域，具体涉及基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法。

背景技术

疟疾是严重危害人类健康的全球三大公共卫生问题之一，在可引起人体疟疾的5种疟原虫中，由恶性疟原虫引起的恶性疟最为严重，常以畏寒、发热、头痛为首发症状，并发症多，若不及时治疗容易危及生命。该病在撒哈拉以南非洲地区流行普遍，发病率和死亡率极高，特别是孕妇和五岁以下儿童深受其害。

20世纪70年代以后，随着疟疾疫情下降，低原虫血症患者所占比例增大，混合感染病例增多。此外，病人药物治疗后的复查或正处于慢性感染阶段等对镜检的要求提高。常规血膜涂片染色镜检法很可能会导致误诊或漏诊，因此，作为金标准的镜检已难以适应疫情变化后的检测需求。此外，由于镜检需要长时间观察、专业判别和复核，难以广泛应用。同时，免疫学方法的不稳定，PCR耗时长、花费高，使得一直以来都难以找到一种实用性和适用性兼备的恶性疟原虫检测方法。2016年世界疟疾报告显示，2015年全球约有2.12亿疟疾新增病例，其中死亡病例约429000例。目前，我国疟疾疫情已经由本地病例为主转变为输入性病例为主，且输入性病例比例逐年上升。特别是近年来，随着国内外经贸往来频繁，出国经商、旅游、留学和度假日益增多，造成我国输入性疟疾疫情愈来愈突出。因此，寻找一种操作简单、快速高效、高特异性和高灵敏度的检测方法迫在眉睫。传统的疟疾检测方法是厚薄血膜涂片经染色后镜检。其优点是操作简单、成本低，能够进行虫种鉴别；不足之处在于其费时、费力，对检验者的专业要求高，特别是检测低原虫血症样本时易漏诊。因此，研究人员建立了基于酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)的疟疾免疫学快速诊断方法。这些方法能够实现检出疟原虫感染的目的，敏感性可与专业镜检媲美，然而其检测效能并不稳定。随后，研究人员开发了基于DNA扩增的分子生物学技术，最常用的有PCR、巢式PCR和实时定量PCR。与镜检相比，分子生物学方法具有更高的灵敏度(最低可检测1～5个疟原虫/μl)和更好的特异性；但该技术存在费用高、须由专业高科技人员操作，且只能在设施配置齐全的实验室进行，从而限制了其在基层医院和医疗卫生条件相对较差地区的应用，而这些地区通常又是疟疾流行范围最广、危害最严重的地区。因此，迫切需要研发一种新的疟疾诊断技术，以弥补镜检、免疫学和常规分子生物学方法的不足。

环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年开发出来的一种新的恒温核酸扩增技术。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)下温育30～60min即可完成DNA扩增反应。与普通PCR相比，LAMP技术不需要模板热变性、复杂的温度循环、长时间电泳及凝胶成像等过程，具有简单、快速、高度灵敏、特异性强的特点，这些独特的优势使其更能为广大医务工作者所接受。目前，已建立了基于恶性疟原虫编码CSP蛋白基因和18S rRNA的LAMP技术，并广泛应用于现场调查。然而，此类高度保守基因在疟原虫属乃至疟原虫科都广泛存在，加之LAMP法是一种高敏感性和特异性的技术，极易造成假阳性，从而导致虫种误判。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供了基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，用以解决现有恶性疟原虫检测方法存在误判等诸多的问题。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法，包括以下步骤：

步骤一，生物信息学分析：搜索PlasmoDB数据库，筛选仅在恶性疟原虫红细胞内期环状体期高表达(前20％)且该种疟原虫特有基因，利用OrthoMCL database验证其在真核生物不同种属间的分布情况，同时，筛选仅在恶性疟原虫红内期滋养体或裂殖体阶段高表达(前20％)且其特有基因各一个，做为平行对照；

步骤二，LAMP引物设计：利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4对步骤一所筛选到的特有基因进行LAMP引物设计，参数设置为默认值，选择分数排名前二至前五的LAMP引物，然后进行LAMP引物合成；