[发明专利]一种大肠杆菌融合表达菌丝霉素、其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种融合表达菌丝霉素、其制备方法和应用，该重组菌丝霉素的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；按照大肠杆菌偏爱密码子设计的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明利用原核表达载体构建了能够表达菌丝霉素‑硫氧还蛋白融合蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。将该菌株扩增培养，通过异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导表达，离心收获菌体，裂解菌体后离心收获上清，经过亲和层析纯化获得菌丝霉素融合蛋白，无需通过酶切去除硫氧还蛋白即可以显著抑制革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等的生长。本发明无需通过酶切去除融合蛋白即可有显著的抑菌作用，大大降低了生产成本。

背景技术

抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质，它是机体先天性免疫系统的重要组成部分。由于抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用，并且随着越来越多的抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加剂等领域有良好的应用前景。菌丝霉素是一种真菌防御素，属于抗菌肽的一种。菌丝霉素的成熟功能片段有40个氨基酸,其分子量为4.4kD,其生物学活性主要表现为对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用,尤其是对肺炎链球菌、脓性链球菌、金黄色葡萄球菌等,有与青霉素、万古霉素相当的抗菌作用。研究表明菌丝霉素在体外抑菌试验、动物试验及一些临床试验中表现出无细胞毒性优势,且不产生耐药性,因此作为抗生素替代物具有相当大的治疗潜力。

目前国内外对菌丝霉素基因工程表达已有了一些研究，但是由于菌丝霉素抗菌肽具有抗菌作用，表达宿主如大肠杆菌中表达的菌丝霉素抗菌肽会反馈性抑制宿主细胞活性，影响菌丝霉素抗菌肽的进一步表达，因此在菌丝霉素抗菌肽基因工程研究中常采用酵母菌表达，或者大肠杆菌中加上大的融合蛋白一起表达后采用酶切去除融合蛋白标签纯化后制得，但两种不同的表达方式成本均较高，不适合广泛用于动物饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品或防腐剂，因此市场上尚无成熟的菌丝霉素抗菌肽产品。而本发明采用大肠杆菌融合表达的菌丝霉素无需酶切去除融合蛋白标签，对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，但对宿主大肠杆菌无明显毒性，解决了菌丝霉素产业化的瓶颈问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合表达菌丝霉素的制备及应用方法，该方法利用大肠杆菌表达系统表达菌丝霉素融合蛋白，所制备的菌丝霉素抗菌肽可应用于治疗、预防革兰氏阳性菌感染或作为畜禽饲料添加剂。

本发明首先提供一种菌丝霉素融合蛋白，由菌丝霉素抗菌肽和硫氧还蛋白融合表达获得，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

上述菌丝霉素融合蛋白的一种基因编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

上述菌丝霉素融合蛋白的表达和纯化的方法，包括以下步骤：

1)根据菌丝霉素和硫氧还蛋白氨基酸序列按照大肠杆菌密码子偏好设计融合基因DNA序列；

2)人工合成步骤1)中融合基因，连接入原核表达载体中，构建成表达重组质粒；

3)将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建能表达菌丝霉素融合蛋白的重组基因工程菌；

4)对该重组基因工程菌进行增值培养和诱导表达培养，收集菌体；

5)将步骤4)所得菌体，进行裂解，离心，收集裂解上清；

6)对步骤5)中所得菌体裂解上清进行Ni-NTA亲和层析纯化，即得菌丝霉素融合蛋白。

本发明的有益效果是：

本发明利用大肠杆菌原核表达系统制备了一种新的菌丝霉素融合蛋白，将菌丝霉素抗菌肽与硫氧还蛋白融合表达，有利于抗菌肽中巯基的形成，实现可溶性表达，同时也有利于菌丝霉素发挥抑菌作用，不必通过蛋白酶切除硫氧还蛋白也可以发挥菌丝霉素抑菌作用，大大降低了制备成本，解决了产业化的瓶颈问题。

附图说明

图1为菌丝霉素融合蛋白的模拟空间构象图；