[发明专利]一种靶向PD‑1的融合蛋白及其相关应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向PD-1的融合蛋白及其相关应用。

背景技术

肿瘤可以通过多种抑制免疫系统及其效应因子的机制来达到免疫逃逸的目的。基于对肿瘤生物学和免疫学原则的不断深入研究，提高抗肿瘤细胞免疫功能和消除肿瘤细胞对免疫细胞抑制性因素，已发展成为免疫治疗的重要策略。在抗肿瘤免疫反应体系中，T细胞作为重要的参与者其反应效应和反应强度受多种共刺激信号和共抑制信号所调控，而其中介导抑制信号的即被称为免疫检查点。

近年来对于免疫检查点与肿瘤免疫逃逸关系的研究越来越深入，包括免疫检查点分子的结构与功能、信号通路、肿瘤表达谱与肿瘤预后等研究也越来越广泛，而其中尤其以PD-1/PD-L为代表的临床肿瘤免疫治疗靶点研究更具应用前景。

作为负性免疫调节因子的PD-1及其配体PD-L分子，其对于肿瘤的治疗效果以及肿瘤预后的重要作用与其受配体相互作用所传递的信号通路密切相关。PD-1是一种细胞膜蛋白受体，调节免疫细胞功能的一个关键点，主要表达于激活的T细胞和B细胞以及其他免疫细胞，PD-1在结构上与免疫球蛋白可变区结构域类似，包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水跨膜区和胞内结构域三个部分，功能是抑制T细胞的过度激活，这是免疫系统的一种正常的自稳机制，因为过度激活的T/B细胞会导致自身免疫病。肿瘤微环境会诱导肿瘤浸润T细胞高表达PD-1分子，同时肿瘤细胞会通过高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2，导致肿瘤微环境中PD-1信号通路持续激活，从而抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。

免疫检查点存在的作用是一方面参与维持对自身抗原的免疫耐受，避免自身免疫性疾病，另一方面避免免疫反应的过度激活对机体组织造成的损伤。更重要的是，以PD-1为代表的免疫检查点分子作为负性免疫调节分子，在介导肿瘤细胞免疫逃逸中同样发挥着重要的作用。由于在正常组织中这些检查点能够抑制T细胞的过度反应，而在肿瘤组织中则能够被肿瘤利用形成免疫逃逸，即肿瘤可以通过免疫检查点来抑制T细胞激活，从而逃避免疫杀伤反应；反之阻断这种检查点所传到的信号则能解除免疫细胞的抑制状态，使其发挥有效的抗肿瘤作用。

基于此，通过激活机体免疫反应以及解除肿瘤微环境中的免疫抑制状态是肿瘤免疫治疗中的核心策略，其中针对以PD-1为代表的免疫检查点分子的阻断是激发免疫细胞活化的有效策略之一，也是近些年抗肿瘤药物开发最热门靶点。因此，通过构建靶向PD-1的蛋白制剂来有针对性地阻断PD-1所介导的信号通路进而增强免疫细胞功能不仅是免疫治疗的重要策略，也是当前肿瘤治疗的急待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的在于提供一种靶向PD-1的融合蛋白制剂，具体而言，一种能靶向并阻断PD-1分子从而增强免疫细胞功能的融合蛋白制剂。

本发明第一方面提供一种靶向PD-1的融合蛋白制剂，所述融合蛋白分别包含氨基端的人程序性细胞死亡配体2胞外段区域和羧基端的人免疫球蛋白G亚型1恒定区片段；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第二方面提供一种靶向PD-1的融合蛋白的编码核酸，所述核酸序列如SEQ ID NO:2所示。由于一种氨基酸可以有多种密码子编码，因此在某些实施方案中，可以根据实际需要对上述编码所述融合蛋白分子的DNA核酸序列的密码子进行突变，特别是使用真核细胞偏好密码子，但所编码融合蛋白的氨基酸序列不变。

本发明第三方面提供一种靶向PD-1的融合蛋白的重组载体，所述重组载体包括SEQ ID NO:2所示的编码核酸；重组载体可选用真核表达载体或者原核表达载体；优选为pcDNA3真核表达载体。

本发明第四方面提供一种细胞株，所述细胞株经过基因工程改造，所述细胞株包括上述重组载体并能够稳定高效地分泌表达靶向PD-1的融合蛋白；细胞株可选用多种工程细胞株，优选人胚肾细胞(293细胞)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。

本发明第五方面提供一种靶向PD-1的融合蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤一，将如SEQ ID NO:2所示的编码核酸导入表达载体，构建重组表达载体；

步骤二，将所述步骤一获得的重组表达载体转入宿主细胞，进一步筛选获得稳定高效分泌表达融合蛋白的细胞株；

步骤三，将所述步骤二获得的细胞株在合适条件下进行扩增培养，收集培养上清并纯化获得融合蛋白。