[发明专利]一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法。

背景技术

随着转基因作物及相关产品在全世界范围内的迅速发展，其环境安全和食用安全问题一直受到各国政府和广大消费者及相关检测机构人员的重视。目前，根据ISAAA机构统计，全球获批生产的转基因玉米已有149种，对转基因玉米的核酸进行分析测试，并保证结果的准确、可靠和有效性，需要阳性参考物的支撑。在保证转基因检测结果的可比性、溯源性，推进转基因产品检测方法标准化等方面，转基因生物参考物发挥着十分重要的作用。

参考物或阳性对照是转基因生物检测监管中进行质量控制的关键，目前转基因检测用阳性对照主要依赖研发者提供，出于自身经济利益考虑，研发者向检测机构提供的阳性样品量一般不大，难以满足转基因生物安全监管工作的需要,因此，构建质粒分子作为阳性样品用于转基因玉米核酸含量分析不失为一种有效的手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法。

本发明所采用的技术方案在于：

一种质粒，所述质粒包括内标准基因和外源基因，所述内标准基因和外源基因之间存在单一酶切位点。

一种参考物质粒的制备方法，所述方法包括在含有内标准基因和外源基因的质粒中插入单一酶切位点，具体的，所述插入单一酶切位点为在内标准基因和外源基因之间插入单一酶切位点；或，所述方法包括将含有内标准基因、单一酶切位点和外源基因的核苷酸片段连入克隆载体中。

一种核酸含量分析和/或基因检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的质粒。

所述质粒、所述方法制备的参考物质粒和/或所述试剂盒在核酸含量分析和/或基因检测中的应用。

所述质粒和/或所述方法制备的参考物质粒在制备核酸含量分析和/或基因检测试剂和/或试剂盒中的应用。

附图说明

图1为本发明的一种实施方式中，构建的质粒DNA的内标准基因和外源基因中间有一个酶切位点，经限制性内切酶切割后，形成线性DNA，内标准基因和外源基因分布在了线性片段的两段，从而形成了质粒参考物，进行实时荧光定量PCR反应。

图2为转基因玉米检测用质粒pBJGMM005的酶切后凝胶电泳检测结果，其中泳道1和6代表100bp Ladder的检测结果，泳道2代表环状质粒DNA的检测结果，泳道3-5代表酶切后线性质粒DNA的检测结果(平行做了3次酶切)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步的描述。

(实施例中所用的原料应能够从商业途径获得，如不可从商业途径获得，请提供该原料的制备方法，如该原料的制备方法中所用的材料不可从商业途径得到，该材料的制备方法也得提供；或者将该原料替换为具有相同作用的可从商业途径得到的其它产品)

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料及试剂：

下述实施例中所用的转基因样品均来自以下两个标准物质研制中心：欧盟IRMM及美国AOCS。

下述实施例中所用的克隆载体pEASY购于北京全式金生物技术有限公司。

实施例1、质粒参考物pBJGMM005的构建及验证

(一)质粒参考物pBJGMM005的构建

(1)内标准基因序列的确定

内标准基因选择的原则是，具备物种特异性，且为单拷贝基因。在玉米中，选择alcohol dehydrogenase1(alc1)基因为内标准基因，核苷酸序列为见序列表中的SEQ ID №.1，对应的引物对与探针见表1。

表1 玉米内标准基因的引物及探针信息

玉米内标准基因的引物及探针信息反应体系见表2。

表2 玉米内标准基因的反应体系

扩增条件见表3。

表3 玉米内标准基因的扩增条件

(2)外源基因的序列的确定

外源基因即指的是通过基因功能手段插入玉米基因组的基因。本实施例中，选用转基因玉米GA21为实验对象，该玉米的外源基因检测方法参考了欧盟的JRC QT-EVE-ZM-014，核苷酸序列见序列表中的SEQ ID №.2。引物和探针见表4

表4 转基因玉米GA21玉米引物及探针信息