[发明专利]一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法

权利要求书

1.一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法，包括如下步骤：

（1）将肠管平均剪切为4段，每段长10-12cm的肠段，用聚乙烯细管将肠管翻转并用细线结扎固定，使肠管肠上皮细胞层暴露，并浸泡在装有平衡盐溶液B的试管中，并多次摇晃试管、更换平衡盐溶液B以洗脱肠管表面杂质；

（2）将平衡盐溶液B更换为消化液A，摇晃试管以洗脱肠管表面粘液；

（3）将消化液A更换为平衡盐溶液B，使用平衡盐溶液B再次清洗肠管多次，以中和消化液A；

（4）将平衡盐溶液B更换为消化液B，多次摇晃试管、更换新的消化液B，以洗脱肠上皮细胞层；

（5）将消化液B更换为平衡盐溶液B，使用平衡盐溶液B再次清洗肠管多次，以中和消化液B；

（6）将肠管自试管中取出，放入无菌平板培养皿中，加入消化液C，放入细胞培养箱，37℃、5% CO₂消化80分钟后取出；消化液C为含10%FBS的 DMEM 培养基+ Liberase TL +DNase I，其中Liberase TL终浓度：0.1-0.2mg/ml，DNase I终浓度：150-250U/ml ；

（7）用移液枪轻柔吹打试管表面数次，将培养液经100um滤网过滤后，于4℃条件下离心1600rpm、5分钟，收集沉淀；

（8）用1ml稀释后抗体混悬步骤（7）所得细胞团，室温下离心3000rpm、3分钟，收集沉淀用流式细胞仪进行细胞分选,得到固有层树突状细胞；所述的抗体选自DAPI、CD11c、MHC-II、CD103或CD11b中的一种或多种；

其中,所述的平衡盐溶液B为不含钙镁离子的PBS;

所述的消化液A为含1mM DTT 的不含钙镁离子的PBS;

所述的消化液B为含30mM EDTA 及30mM EGTA 的不含钙镁离子的PBS;

流式细胞仪分选时设置DAPI- CD11c+ MHCII+即可得到固有层树突状细胞；或在此基础上，同时加做CD103或CD11b染色以行树突状细胞亚群分选或分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的消化液C中Liberase TL终浓度为0.167mg/ml，DNase I终浓度为200U/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（8）中以流式缓冲液稀释抗体，抗体的稀释比为1：100。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的流式缓冲液为含钙镁离子的PBS +5%FBS。