[发明专利]一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点PDANS@Ag/GQD的电化学发光生物传感器的制备方法，具体涉及到将石墨烯量子点GQD作为发光材料，利用银掺杂的聚多巴胺纳米微球PDANS@Ag的高负载性和电化学稳定性负载石墨烯量子点作为标记物，多壁碳纳米管负载Pd纳米立方体复合物作为基底材料用于固定凝血酶核酸适配体，制备一种检测凝血酶的信号关闭型电化学发光生物传感器，属于新型功能材料与生物传感技术领域。

背景技术

由丝氨酸蛋白质水解而成的凝血酶是一种重要的丝氨酸蛋白酶。在人体生理和病理过程中都发挥着重要作用，可以作为相关疾病诊断的生物标识物。衡量凝血机制的重要指标是凝血酶的浓度和活性，对于揭示肿瘤的发生机制及作为早期诊断、治疗、疗效及愈后的判断依据意义重大。

电化学发光分析是对电极施加一定的电压进行电化学反应,反应的产物之间或反应的产物与体系中的某种组分发生化学反应，产生激发态物质，激发态物质回到基态时产生发光，根据发光光谱和强度对物质进行痕量分析的一种方法。该法具有灵敏度高、线性范围宽、过程控制性强、选择性好、仪器简单、无放射性等优点；同时，核酸适配体是通过SELEX技术筛选出来的，将筛选出来的适配体作为识别元件与电化学发光传感器相结合，具有适配体的高选择性和特异性结合的优势。本发明制备了一种基于银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器。

本发明采用原位还原的方法，将银纳米粒子原位生长在聚多巴胺纳米微球表面，利用聚多巴胺纳米微球大的比表面积及高负载特性负载大量的石墨烯量子点，不仅实现了石墨烯量子点作为标记物的用途，而且增强了石墨烯量子点的电化学发光稳定性和发光强度，降低了背景信号。多壁碳纳米管负载Pd纳米立方体复合物作为基底材料用于固定凝血酶核酸适配体，凝血酶核酸适配体与连接有银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点复合物的探针pDNA形成杂交双链，由于凝血酶可以识别凝血酶核酸适配体，从而使得探针pDNA脱离电极表面，导致电化学发光信号的降低，构建了一种信号关闭型电化学发光生物传感器。

发明内容

本发明目的之一将凝血酶核酸适配体固定在多壁碳纳米管负载Pd纳米立方体复合物基底上，使凝血酶核酸适配体与连接有电化学放光材料的探针pDNA形成杂交双链。

本发明的目的之二是用银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载大量的石墨烯量子点PDANS@Ag/GQD作为电化学发光材料，提高了石墨烯量子点的电化学发光稳定性与发光强度，降低背景信号。

本发明目的之三是构建一种灵敏的检测凝血酶的信号关闭型电化学发光生物传感器，通过凝血酶核酸适配体识别凝血酶之后使得连接有电化学发光材料的探针pDNA脱离电极，从而导致信号降低，实现凝血酶的高灵敏、快速地检测。

本发明的技术方案如下：

1. 一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法

（1）PDANS@Ag的制备

80~120 mg盐酸多巴胺加入到80~120 mL pH = 8.8的Tris-盐酸缓冲溶液与30~70 mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24 h，将产品离心分离并用超纯水洗涤五次，之后将产物分散到5 mL超纯水中备用；取1 mL PDANS稀释到5mL超纯水中，在搅拌的条件下依次加入500~700 mg柠檬酸三钠、20 mL 0.015~0.035 mol/L AgNO₃ 溶液，通入N₂除氧，避光条件下搅拌反应2.5 ~ 4.5 h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤三次，最后产物真空干燥；

（2）GQD的制备

称取2 g 柠檬酸置于100 mL烧杯中，将烧杯置于200℃鼓风干燥箱中，5 min后柠檬酸开始熔解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，30 min之后变成橘黄色，表明GQD的生成，之后用100 mL、8~12 mg/mL的NaOH溶液调节至中性，制得GQD溶液；

（3）巯基化GQD的制备

分别将13.4~17.4 mg巯基乙胺、85.8~105.8 mg EDC加入到20 mL GQD溶液中，室温下振荡反应24 h，将反应后的溶液透析两天，制得巯基化GQD；

（4）PDANS@Ag/GQD的制备

将1~3 mL巯基化GQD溶液与1~3 mL浓度为2 mg/mL PDANS@Ag溶液混合，室温下震荡12 h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/GQD；