[发明专利]一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物：AP‑F：5'‑AACARATAGATAGGGGCAGTA‑3'；AP‑R：5'‑TCTTCCGTCAATTTCTTTAA‑3'。本发明具有成本低、操作简便的特点，具有良好的稳定性以及组内和组间重复性，因此，适用于梭子蟹肌孢虫微量潜伏感染时期的监测和对“牙膏病”暴发风险的准确评估；同时，也具有较高的检出率，显示了较高的检测灵敏性，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于三疣梭子蟹疾病检测领域，特别涉及一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒。

背景技术

近年来，我国养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)普遍流行一种以肌肉白浊为典型特征的疾病，俗称“牙膏病(toothpaste crab)”，研究者通过病理学和分子生物学等方法诊断出该病病原为一种微孢子虫——梭子蟹肌孢虫(Ameson portunus)。据我们2013年以来的流行病学调查结果，我国东黄海野生三疣梭子蟹肌孢虫感染率平均为6.9％，江苏、上海沿海感染率高达10.6％；养殖三疣梭子蟹感染率更高，流行地区感染率高达90％以上，气温降低后发病蟹大面积死亡以致塘口绝收，未发病蟹也由于经济价值丧失而对养殖业造成重大经济损失。由于微孢子虫在宿主细胞内寄生并拥有坚固的几丁质外壳保护，到目前为止仍然没有较好的治疗和控制措施，建立病原的早期定量诊断技术，及早预警病原感染和疾病暴发风险，对于该病的防控具有重要意义。

聚合酶链式反应(PCR)可通过对特定核苷酸片断进行指数级的扩增实现对微量目的基因的检测，而实时荧光定量PCR技术是在传统PCR扩增的基础上，通过对反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板的定量及定性分析，不仅灵敏度更高，还可以实现对病原感染量的准确认定，有利于及早、准确评估疾病发生风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒，该试剂盒具有成本低、操作简便的特点，具有良好的稳定性以及组内和组间重复性，因此，适用于梭子蟹肌孢虫微量潜伏感染时期的监测；同时，也具有较高的检出率，显示了较高的检测灵敏性，具有良好的应用前景。

本发明的一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物：

AP-F：5'-AACARATAGATAGGGGCAGTA-3'；

AP-R：5'-TCTTCCGTCAATTTCTTTAA-3'。

所述试剂盒还包括2×SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ。

所述试剂盒的PCR反应体系为：总体积10μl，2×SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ5μl，1.0μmol/L上、下游引物各2μl，DNA模板1μl。

所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃30s预变性；然后，95℃5s，60℃20s，循环40次。