[发明专利]稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株降低对pH敏感性的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物保护和生物技术领域，尤其涉及一种稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株降低对pH敏感性的方法。

背景技术

一些真菌在其与环境持久的互作过程中已经进化出复杂的调控机制识别和响应其周围的pH变化。另外，一些真菌依据其周围不同pH，能分泌不同的蛋白。为了成功侵入寄主，在侵染过程中(Botrytis cinerea)灰葡萄孢菌在寄主的不同组织分泌不同的蛋白。尽管只有一些“真正的”毒性因子是成功抑制寄主防御响应的，但仍需要不同的胞外分泌蛋白协同起作用。构巢曲霉菌中的7个蛋白与pH识别相关(et al.,2008)，其中的两个蛋白PalH和PalI是推测膜蛋白，PalH(7个预测跨膜螺旋)携带有pH识别活性。通过对PACC缺失菌株的研究表明，pH信号途径在各种致病真菌毒性中的作用。PACC的缺失会对真菌分泌代谢产物或裂解酶产生极大地负作用。因此，pH信号途径似乎控制许多细胞功能，而这些细胞功能与病菌的各种侵染过程相关。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株降低对pH敏感性的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括以下步骤：

(1)分别将稻瘟病菌效应蛋白过表达菌株接种于pH5和pH8的蕃茄燕麦培养基中培养10天；

(2)用灭菌棉签将培养基表面长满的菌丝刮掉，再将刮掉菌丝的培养基放置于培养箱中进行12小时黑暗12小时光照处理3天；

(3)用灭菌水清洗培养基表面的孢子，取10μl孢子悬浮液于载玻片上于显微镜下进行孢子计数，统计产孢量；

(4)分别用pH5和pH8的缓冲液清洗孢子，将孢子悬浮液置于洋葱表皮于28℃培养箱中培养，于6h时于显微镜下观察孢子萌发率及附着胞形成率。

进一步，所述步骤(4)中用pH5和pH8的缓冲液清洗孢子处的孢子是在未经调整pH的蕃茄燕麦培养基上培养的孢子。

本发明的有益效果在于：

本发明是一种稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株降低对pH敏感性的方法，与现有技术相比，本发明提供一种更为简便、有效准确地确定稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株对不同pH的敏感性，为快速了解过病原菌效应蛋白基因过表达菌株的致病性提供了重要的参考依据。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明：

本发明包括以下步骤：

(1)分别将稻瘟病菌效应蛋白过表达菌株接种于pH5和pH8的蕃茄燕麦培养基中培养10天；

(2)用灭菌棉签将培养基表面长满的菌丝刮掉，再将刮掉菌丝的培养基放置于培养箱中进行12小时黑暗12小时光照处理3天；

(3)用灭菌水清洗培养基表面的孢子，取10μl孢子悬浮液于载玻片上于显微镜下进行孢子计数，统计产孢量；

(4)分别用pH5和pH8的缓冲液清洗孢子，将孢子悬浮液置于洋葱表皮于28℃培养箱中培养，于6h时于显微镜下观察孢子萌发率及附着胞形成率。

进一步，所述步骤(4)中用pH5和pH8的缓冲液清洗孢子处的孢子是在未经调整pH的蕃茄燕麦培养基上培养的孢子。

分别用pH5和pH8处理稻瘟病菌效应蛋白基因过表达菌株孢子，统计产孢量、孢子萌发率及附着胞形成率。本发明中稻瘟病菌孢子培养、培养及配制、统计等方法均与常规相同。本发明中稻瘟病菌孢子培养、培养及配制、统计等方法均与常规相同

本发明的有益效果是全面而准确地通过检测稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子的产孢率、孢子萌发率和附着胞形成率，明确病原菌效应蛋白、非生物因子和病原菌三者间的关系，即病原菌效应蛋白基因在稻瘟病菌株内过表达后对菌株形态学的影响及其对非生物因子的响应。克服了已有在研究非生物因子、病原菌效应蛋白基因与病原菌三者关系时不确定及无法开展的弊端，最终达到为今后研究非生物因子、病原菌效应蛋白基因及病原菌三者关系提供了简便清晰地思路方法。具体方法是配制pH5和pH8的培养基，将过表达菌株菌丝接种于培养基上，待到10天左右进行产孢数统计，同时用pH5和pH8处理过表达菌株的孢子，显微镜下观察孢子萌发率和附着胞形成率等。可快速、简便准确地了解病原菌效应蛋白基因过表达菌株产孢率、萌发率和附着胞形成率对pH的敏感程度，克服了已有研究病原菌效应蛋白基因过表达菌株致病机制的弊端。

实施例一：