[发明专利]一种基于MPN与PCR的食品中沙门氏菌快速定量方法

说明书

技术领域

本发明属于检测领域，涉及沙门氏菌的检测方法。

背景技术

沙门氏菌分布广泛，学界共识认为该菌是食品中污染程度最高的一类菌，在世界各地的细菌性食物中毒病例统计中，由沙门氏菌引起的案例数常占首位或次位。迄今为止，世界范围内已经报道的沙门氏菌血清型大于2600种。沙门氏菌导致的伤寒、副伤寒、发热等是发展中国家最为常见的疾病，在环境卫生条件较差的地区甚至会导致死亡。有报道显示，每年全球有大约9400万例肠胃炎以及15.5万例死亡病例均是由沙门氏菌导致，其中有85%是食物引起的。

在中国，沙门氏菌对食品安全的污染同样严重，作为首要的食源性致病因素，沙门氏菌导致了近70%~80%的食源性疾病。Yang等结果显示，在全国范围内抽检的539份即食食品中，有19份检出了沙门氏菌，总检出率达3.52%，大部分阳性样本污染程度为0.3~10 MPN/g，部分样本甚至污染水平高达110 MPN/g。申请人项目组为了解本省（江西省）食品中食源性沙门氏菌污染情况，抽检本省13类3437份食品，并对分离的沙门菌进行血清型鉴定试验。结果显示，所检3437份食品中检出受沙门菌污染样本155份，沙门菌检出率达4.51%，其中生禽肉、生畜肉中的沙门菌检出率分别高达27.4%、13.7%，意味着，在我省平均每4份生禽肉样本就有1份污染了沙门氏菌。综上所述，沙门氏菌在全国乃至世界范围内对食品安全构成了严重威胁，而我省的污染情况尤为严重。

常规的检测沙门氏菌的方法为培养法，该方法涉及到前增菌、选择性增菌培养、生化鉴定以及血清分型等后续鉴定步骤。此法虽是目前微生物鉴定和仲裁结果判定的标准方法，但通常需要花费数天的检测时间，需要特殊的操作环境及繁琐的步骤，且方法为定性方法，无法实现定量检测，无法满足食品安全风险评估等工作对食品样本中沙门氏菌定量检测的需要。

另外，也有研究者采用免疫学或者荧光定量的分子生物学手段实现了沙门氏菌的定量检测，但方法定量均依赖于预设的标准曲线，一旦检测环境、试剂、操作步骤、检测样本等出现改变就会导致定量结果出现偏差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食品及相关样本中的沙门氏菌携带量（污染量）的评估方法。

本发明所提供的方法基于MPN（Most Probable Number，最大或然数）及PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）的技术原理。所述方法不依赖于预设标准曲线，在实现沙门氏菌的定量的前提下又兼具PCR方法的快速、准确的优点。

整个检测过程可以在两个工作日内完成，相比传统基于培养的方法可有效缩短检测流程、节省工作量；相比其他沙门氏菌定量方法，本法无需建立标准曲线，规避了不同样本及检测环境的差异的影响。方法简便易操作，结果准确，特别适用于食品安全风险评估等工作中对鲜活生冷等食品样本中沙门氏菌污染剂量或带菌水平的快速估计。过程见图1。

技术方案具体如下：

一种基于MPN与PCR的食品中沙门氏菌快速定量方法，包括以下步骤：（1）食品样本的梯度稀释；（2）菌的复苏及增菌培养；（3）DNA的提取；（4）沙门氏菌属特异性引物PCR扩增及PCR结果检测；（5）MPN法估计原样本中沙门氏菌浓度；

食品样本的梯度稀释过程包括：称取25g或25mL食品样本加入225mL无菌BPW中，拍击式均质25s或其他方式充分震摇混合，使食品样本表面或内部可能存在的沙门氏菌散布于BPW中，静置数秒所得上清液作为1:10样本稀释液。吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL BPW的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管；

菌的复苏及增菌培养过程包括：根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL BPW的试管，每管接种1 mL。置36 ℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h；

DNA的提取过程包括但不限于：分别取上述增菌液1 mL，8000 r/min离心，弃去上清液以去除有机酸等细菌代谢产物对PCR的不利影响，无菌水重悬后采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；