[发明专利]人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白包括人血清白蛋白HSA组成的第一区和人突变型肝细胞生长因子HGF组成的第二区，所述人突变型肝细胞生长因子是指肝细胞生长因子第494位的氨基酸R突变成N、D、K、Q或G。本发明利用不经过蛋白水解酶作用就具有生物学活性的HGF突变体制备HSA‑HGF融合蛋白，该融合蛋白保持了人肝细胞生长因子生物活性基础上，提高了其在CHO系统中的表达量，简化了分离纯化操作。本发明的融合蛋白在保持了人肝细胞生长因子的生物活性前提下延长了其在体内的半衰期，提高了HGF的表达量，在药学领域有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于长效融合蛋白药物技术领域，更具体地讲，涉及人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右。成熟的HSA由585个氨基酸组成，分子量为66.5kDa，含有17对二硫键，一般为单链无糖基化蛋白质。在正常情况下，不易被肾小球滤过，血浆半衰期在20天左右。HSA广泛用于血浆容量扩充剂，还可作为赋形剂和稳定剂，用于各种药物制剂及无血清培养基的组分。HSA是一种稳定的惰性蛋白，能作为药物载体，赋予药物更好的理化特性。同时，HSA在人体内没有酶学和免疫学活性，是一种理想的生物活性蛋白载体。当目的多肽与HSA融合表达时，不仅可以提高多肽药物的表达量，还可以提高多肽药物的稳定性。

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是生长发育过程中必须的一种活性蛋白物质，具有促进肝细胞生长及肝脏发育效应，主要由肝脏产生和分泌。80年代，T.Nakamura等首先从部分肝切除大鼠的血清中发现一种可以促进肝细胞增殖的蛋白质，并命名为肝细胞生长因子。肝细胞生长因子作为一种多功能生长因子，主要由肝脏的储脂细胞生成，它不仅能够刺激肝细胞DNA的合成，参与多种细胞的增殖、迁移和形态发生，对多种成熟的器官/组织有修复作用。HGF在体内以单链前体被合成和分泌，在蛋白水解酶作用下水解成有活性的双链分子。成熟的HGF是由一个69kDaα链和34kDaβ链组成的异二聚体。单链HGF也能与受体c-Met高亲和力结合，但是不能激活受体，不具有生物学活性。HGF基因是一种多功能基因，正常情况下，HGF/c-Met只是短暂的激活，产与正常胚胎形成、组织再生、创伤修复以及血管生成等。当机体肾脏、肝脏或心脏损伤时，HGF/c-Met基因表达均上调，暗示了HGF的保护作用，在组织损伤时维持体内的平衡。作为一种多功能生长因子，HGF不仅能够刺激肝细胞DNA的合成，还参与多种细胞的增殖、迁移和形态发生，对多种成熟的器官/组织有修复作用。HGF作用于唯一受体c-MET，HGF与c-Met结合后，催化c-Met发生自身磷酸化，磷酸化后其酪氨酸激酶活性增强，导致多种底物蛋白如PLC-r、PI3-K、Gab1、Grb2、STAT3和SHP2等的酪氨酸残基磷酸化。这些底物蛋白经不同的信号通路发挥多种生物学活性，如细胞增值、血管生成、细胞迁移、细胞凋亡等。此外，HGF单体在体内的半衰期较短，只有3-5分钟，如此短的半衰期需要大剂量或者反复注射，导致治疗成本增加与治疗过程困难，融合蛋白HSA-HGF提高了实际应用的竞争力。

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)是1957年美国科罗拉多大学Dr.Theodore T.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生物工程上广泛使用的细胞系。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或预防的基因工程产品约30多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的。大肠杆菌易于操作，产量高，成本低，但其生产的药物蛋白无糖基化，不能形成有活性的二聚体，在人体内易被降解，且易产生内毒素及包涵体问题。CHO细胞属于成纤维细胞，是非分泌型细胞，由于自身很少分泌内源蛋白，因此可以简化目的蛋白分离纯化操作，能在无血清培养基中高效生产重组药物蛋白，是表达生物大分子的理想宿主。已广泛应用于抗体、基因重组药物、病毒疫苗等生物技术产品的研发与生产。