[发明专利]赤皮青冈无菌外植体制备及初始芽诱导方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其是涉及一种赤皮青冈无菌外植体制备及初始芽诱导方法。

背景技术

赤皮青冈(Cyclobalanopsis gilva (Blume) Oerst),属壳斗科青冈属(Cyclobalanopsis Oerst)植物，为常绿乔木，高达30米，树皮暗褐色，耐贫瘠，在我国广泛分布于浙江、湖南等省。赤皮青冈心材呈深红褐色，边材呈黄褐色，纹理直，质坚重，强韧有弹性，气干密度0.85-0.91克/立方厘米，用途广泛，经济价值很高，是我国珍贵的硬材树种之一。由于大量砍伐，已沦为濒危树种。一方面，赤皮青冈种子属于顽拗性种子，其萌发时间很长，发芽率较低，且容易遭虫害，不易保存，存活率很低，有性繁殖速度慢；另一方面,有性繁殖不能保证林木的优良特性，然而，组织培养能通过无性繁殖，遗传树种的优良特性，能在短时间内快速繁殖获得大量优质的组培苗，为优质种源推广提供可能。

赤皮青冈属组织培养困难的树种，主要是因为外植体消毒困难，还有在初始芽诱导培养过程中，易褐化、初始芽发生率低、芽苗不伸长、活性差等瓶颈问题，严重限制了赤皮青冈优良无性系的推广与应用。

发明内容

本发明针对现有赤皮青冈组织培养中外植体消毒困难、褐化、初始芽发生率低、芽苗活性差等的技术问题，提供一种赤皮青冈无菌外植体制备及初始芽诱导的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下

一种赤皮青冈无菌外植体制备及初始芽诱导方法，包括外植体准备、外植体消毒处理以及初始芽诱导工序，采集赤皮青冈当年生嫩枝作为外植体，进行消毒处理后，获得的无菌外植体接种于初始芽诱导培养基中，在适宜环境中培养20-30天后，获得生长快、活力旺盛的赤皮青冈初始芽，其操作步骤如下：

（1）外植体准备：

在至少连续3天晴朗的气候里，采集赤皮青冈的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体；

（2）外植体消毒处理：

将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1-0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡20-30 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1-2 min，再移入体积浓度为5-8 %的氯化汞溶液中浸泡10-20 min，取出放于体积浓度为10-25 %的双氧水和2-5滴吐温的混合液中搅拌浸泡20-30 min后，最后用无菌水洗3-4次，每次冲洗3-5 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；

将步骤（2）得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）0.5-2.0 mg·L^-1 + MT 1.0-3.0 mg·L^-1 + 6-BA 1.0-3.0 mg·L^-1 + 葡萄糖30 g·L^-1 + 琼脂3.5 g·L^-1 + 0.1-0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-30天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的赤皮青冈初始芽。初始芽萌动率在90%以上。