[发明专利]一种洋金花药材的鉴别方法

权利要求书

1.一种洋金花药材的鉴别方法，其特征是：包括：

基于共振波导光栅传感器的二相表型药理鉴别法，

(1)药材的提取

精密称定1g药材粉末，置锥形瓶中，加入10mL浓度为2mol/L的盐酸溶液，超声处理，功率250W，频率40kHz，30分钟，放冷，滤过，滤渣和滤器用10mL上述盐酸溶液分数次洗涤，合并滤液和洗液，用浓氨试液调节pH值至9，用三氯甲烷振摇提取4次，每次10mL，合并三氯甲烷，回收溶剂至干，残渣用缓冲液溶解，转移至5mL量瓶中，加缓冲液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用于测试；

(2)用共振波导光栅传感器检测药材提取液刺激CHO-M₂细胞所产生的药理表型

取20μL CHO-M₂细胞悬液接种在细胞测试板中，放入含有5％二氧化碳、温度为37℃的培养箱中培养14小时，取出细胞测试板，移除培养基，用移液枪向每个孔中加入20μL Hank's平衡盐溶液，将测试板放入Corning Epic BT系统进行信号平衡，1小时后，将基线归零并启动一个新的信号记录程序，记录2分钟后，暂停程序，用排枪将10μL提取液加入每个微孔中，并继续记录1小时；如果加入药材提取液后检测信号超过100pm，则该表型记为1；若信号在-100到100之间，则该表型记为0；若信号小于-100，则该表型记为-1；药材提取液在该阶段所产生的动态质量再分布信号即为第一相表型；

(3)用共振波导光栅传感器检测乙酰胆碱和药材提取液共同刺激CHO-M₂细胞所产生的整合药理表型

在上述记录程序结束后，重新开始一个程序；信号记录2分钟后暂停程序，用排枪向每个孔中加入10μL浓度为16μM的乙酰胆碱Hank's平衡盐溶液，然后继续记录程序1小时，如果加入乙酰胆碱溶液后信号超过100pm，则该表型记为1；若信号在-100到100之间，则该表型记为0；若信号小于-100，则该表型记为-1；该阶段产生的动态质量再分布信号即为第二相表型；

(4)整合第(2)、(3)步的表型，并与洋金花药材表型进行比对

如果满足(1, 0)则为洋金花，其中“ 1”为步骤(2)的表型，“ 0”为步骤(3)的表型，否则，即为伪品药材；

(5)基于共振波导光栅传感器的二相表型药理鉴别法与HPLC的联合用于鉴定洋金花药材质量

按照如下条件对洋金花进行HPLC分析，将成分的峰面积或含量与药材活性值进行关联；

流动相A：含有0.0025mol/L庚烷磺酸钠的水溶液，用磷酸调至pH＝5；

流动相B：乙腈；

分离条件为(以B％表示)：

0-13min，16-16％；

13-20min，16-18％；

20-28min，18-18％；

28-30min，18-20％；

30-42min，20-20％；

42-60min，20-25％；

流速为1.0mL/min；

检测波长为215nm。

2.根据权利要求1所述的洋金花药材的鉴别方法，其特征在于，CHO-M₂细胞是指能够稳定表达毒蕈碱M₂型胆碱受体的中国仓鼠卵巢细胞。

3.根据权利要求1所述的洋金花药材的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)所述的缓冲液为Hank's平衡盐溶液。

4.根据权利要求1所述的洋金花药材的鉴别方法，其特征在于，步骤(2)所述的培养基为含有10％胎牛血清、80U/mL青霉素、0.08mg/mL链霉素、0.4mg/mL遗传霉素和0.08mg/mL博来霉素的HyClone Ham's F-12营养液。

5.根据权利要求1所述的洋金花药材的鉴别方法，其特征在于，步骤(2)所述的CHO-M₂细胞密度为2,5000个/孔。

6.根据权利要求1所述的洋金花药材的鉴别方法，其特征在于，步骤(2)所述的细胞测试版为Epic 384孔细胞测试板或纤维蛋白覆盖的Epic 384孔细胞测试板。