[发明专利]一种RNA反义纯化方法

权利要求书

1.一种RNA反义纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1、细胞的交联、裂解及基因组DNA的消化，得到RNA样品；

S2、探针组溶液的制备：将生物素标记的各探针溶解后混合，于85℃变性3min，快速转移冰浴，得到探针组溶液；

S3、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；

S4、探针组-磁珠复合物的制备：将探针组溶液加入到预处理后的磁珠中，得到探针组-磁珠复合物；

S5、反义纯化：向RNA样品中加入探针组-磁珠复合物，65℃变性10min，37℃、42℃和45℃各洗涤2次，每次洗涤5min，得到RNA-探针组-磁珠复合物；

S6、RNA的洗脱：将RNA-探针组-磁珠复合物加入RNA ElutionBuffer混匀，95℃加热2min，收集上清，向上清中加入Proteinase K Buffer和Proteinase K，温育消化得到洗脱后的RNA；

S7、RNA的纯化：向洗脱后的RNA中加入等洗脱体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液混匀，离心收集上层水相，向水相中加入5M NaCl溶液、glycogen和无水乙醇，混匀后-80℃沉淀1～16h，离心弃上清，加入预冷的80％乙醇，离心弃上清，室温静置风干，加入无RNase水，65℃温育15min。

2.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S1中取约1×10⁸个细胞，去除培养基后用PBS洗涤一次，进行紫外交联，向交联后细胞中加入15ml预冷的PBS并短暂置于冰上，收集细胞，4℃400g离心3min收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入1.4ml预冷的Lysis Buffer、5μl RNase Inhibitor，充分吹打裂解，抽动混匀3次，冰浴静置裂解10min，向裂解液中加入4.8μl DNase Salt Stock、15μl DNase，37℃温育10min；转移样品到冰浴环境，快速加入20μl 0.5M EDTA、10μl 0.5M EGTA、5μl 1M DTT并充分混匀；加入等体积2×Hybridization Buffer，充分混匀后冰上静置10min；4℃16000g离心10min，转移上清至新无RNase离心管中，-80℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S2中每条探针用1×TES配制成100倍nmol的探针溶液，将所有探针溶液混合，取5μl混合液变性处理。

4.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S3磁珠预处理的方法为：用1ml 10mM Tris-HCl pH7.5重悬磁珠，颠倒混匀后磁力架上收集磁珠去上清，再重复洗涤2次；用1ml 1×Hybridization Buffer重悬磁珠，颠倒混匀后磁力架上收集磁珠去上清；再向磁珠中加入1ml含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液。

5.根据权利要求4所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S3中TES中BSA的浓度为0.05～0.5wt％，寡核苷酸随机引物的浓度为10～20μmol/L。

6.根据权利要求4所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S3中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。

7.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S4制备探针-磁珠复合物的方法为：将探针组溶液加入预处理后的磁珠中，并加入100μl 2×TES，25℃温和旋转混合30min，磁力架上收集磁珠去上清；用0.35ml1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。

8.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S5中向RNA样品中加入探针组-磁珠复合物，65℃温育变性10min，用含0.5mM PMSF的Wash Buffer 37℃、42℃、45℃各洗涤2次，每次洗涤5min并磁力架上静置1min收集磁珠弃上清；用500μl Wash Buffer悬浮磁珠，35℃摇动洗涤2～4min，磁力架上收集磁珠并去上清，并重复洗涤3～6次，得到RNA-探针组-磁珠复合物。