[发明专利]人工染色体载体

说明书

本申请是申请号为“200980147845.0”，申请日为2009年11月18日，优先权日为2008年11月28日，发明名称为“人工染色体载体”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及一种在哺乳动物宿主细胞系中生产蛋白质的方法。

哺乳动物细胞系统中的重组蛋白生产是生物技术中的一项重要话题。重组蛋白生产中的一个关键步骤是生成表达高水平的感兴趣蛋白质的细胞系及分离其中超越细胞分裂周期和时间具有稳定表达的单细胞克隆(Wurm,F.M.Nature Biotechnology 22,1393-1398(2004))。需要生成在工业规模上在细胞培养中稳定、安全、可靠且可再现地表达高产量的分泌蛋白的细胞系的方法。特别地，这种需要随着制药工业为治疗而开发和生产的生物制品的量日益增多而日益增强。

通常，这是通过含有启动子、感兴趣基因和选择标志的表达载体随机基因组整合入已建立的生产细胞系的染色体DNA中而实现的。

常用的生产细胞系是自哺乳动物或昆虫细胞衍生的。细胞系为永久建立的细胞培养物，给予适宜的新鲜培养基和空间，它就会无限增殖。细胞系与细胞株的区别在于它们规避了海弗利克(Hayflick)极限(Hayflick L.(1965)."The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains."Exp.Cell Res.37(3):614–636)且变得永生化。已建立的生产细胞系的例子有CHO、NS0、COS、或Sf9细胞，或人细胞系像PerC-6和HEK293。

对于哺乳动物细胞以及细胞系的遗传工程，通常使用质粒作为载体。质粒为与染色体DNA分开的非染色体DNA分子，其能够在细菌中独立于染色体DNA而复制。在许多情况中，它是环状的及双链的。在正在增殖的哺乳动物细胞中，在随机整合入宿主细胞的基因组中之后，质粒能在宿主细胞中无限维持，而且能经其启动子导致感兴趣基因/产物的生成，通常是蛋白质。

虽然这种遗传工程方法是简单的及直截了当的，但是它缺乏可再现性。自此类载体表达蛋白质受到整合位点周围的染色质的实质性影响，其趋于随时间而使表达沉默(Wurm,F.M.Nature Biotechnology 22,1393-1398(2004))。这使得合适克隆的选择成为一种冗长且费时的规程。

已经开发了数种策略来克服邻近染色质的位置效应。例如，使用载体侧翼的“抗阻抑物”元件，或者将载体特异性整合入具有开放染色质的染色体基因座中(Kwaks,T.H.et al.Nature Biotechnology 21,553-558(2003),Huang,Y.et al.Journal of Immunological Methods 322,28-39(2007))。

本领域已经使用人工染色体来提供转基因宿主，诸如动物或植物。

WO2002/097059A2记载了经改造而含有位点特异性、重组指导的DNA整合的位点的人工染色体，对于改造转基因动物特别有用。

US2008/0060093A1披露了生成经自主微型染色体转化的植物的方法。

Moralli et al(EMBO reports 2006 Vol 7(9)911-918)披露了人类人工染色体(HAC)载体，其作为基因转移系统用于表达和互补研究。

适宜蛋白质表达载体的开发构成真核细胞系中的重组蛋白生产中的一个关键步骤。对于细胞培养中的重组蛋白生产，一般试图使载体展示下述特征：

1)表达应当独立于基因组中的转化位点，

2)表达应当与整合的转基因拷贝数有关，

3)表达应当随时间而维持，及

4)表达水平应当高。

本发明的目标是提供容许生成稳定细胞克隆的方法和载体，以改善真核生产细胞系中的重组蛋白生产。

本发明的主题解决了该目标。

依照本发明，提供了一种在真核细胞系中生产蛋白质的方法，包括下述步骤：

a)提供人工染色体的骨架，

b)将编码所述蛋白质的核酸重组入所述骨架中以生成表达载体，

c)将所述表达载体导入真核宿主细胞系中以获得真核表达细胞系，

d)培养所述表达细胞系以生成所述蛋白质，并

e)分离所述蛋白质。

如此，依照本发明使用的表达细胞系具有基于人工染色体的整合表达载体。