[发明专利]一种检测人乳头状瘤病毒的PCR试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测人乳头状瘤病毒的PCR试剂盒及其制备方法，属于人乳头状瘤病毒亚型的检 测领域。本发明涉及应用多重实时荧光定量PCR技术在四个PCR反应管中同时快速地定型定量检测 13种人乳头状瘤病毒的方法。

背景技术

人乳头状瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)是一种双链DNA病毒，属于乳头瘤病毒属，是 一种特异性感染皮肤或粘膜复层上皮的病毒。目前，HPV已被发现的亚型有接近两百种，其中大部分 感染人类后并没有表现出明显的症状，少数部分有病理表现，有些可能会引起人类疣，如生长在生殖 器附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣。一些高危亚型会引起人类的肿瘤，导致宫颈癌、阴道 癌、肛门癌、阴茎癌等的发生。其中超过30种HPV亚型的传播是通过性接触而引起生殖区的病变。

HPV感染是宫颈癌的直接病因，从感染到最终宫颈癌的发生对大多数患者而言有一个缓慢的潜伏 期。因此，及时定期对宫颈脱落细胞进行HPV的检测在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环 节中显得尤为重要。宫颈癌早期症状不明显，筛查预警对早期发现宫颈癌，降低死亡率极为重要。目 前HPV的诊断完全依赖于临床标本中HPV DNA的检测。HPV分型与临床的结合研究已经证实不同的 HPV基因型和不同的病毒载量有着不同的致癌性，因而HPV DNA的分型定量检测对宫颈癌及女性生 殖道肿瘤的病因学和癌前预报具有重要的意义。

在1995年的IARC专题讨论会上确定了HPV某些亚型长期和反复地感染HPV是宫颈癌发生的 主要原因。目前，人类把与宫颈癌发生有关的HPV亚型称为高危亚型，有HPV16，18，31，33，35， 39，45，51，52，56，58，59，68等；与肿瘤不相关的称为低危亚型，最常见的为HPV 6，11和44等。

由于HPV至今尚不能在体外培养，又无合适的实验动物，因而对其检测主要依赖于形态学鉴定 和分子生物学检测技术。目前HPV检测方法主要有组织细胞病理学检测、斑点印迹法、荧光原位杂交 法、Southern杂交法、多聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction,PCR)和杂交捕获法等。细胞学 法敏感度和特异度较低，斑点印迹法具有放射性。敏感度较高的方法有原位杂交与传统PCR法，但核 酶印迹原位杂交法复杂，传统PCR法特异性很低，假阳性率较高，不宜大规模临床使用。

目前HC-II是一通过食品和药物管理局(FDA)批准的可临床使用的检测HPV DNA的技术，但其不 能对HPV进行具体定量，且存在交叉杂交产生感染的问题。

多重实时荧光定量PCR技术不仅可以检测具体病毒型别还可以检测病毒负荷量，是一个有较大发 展前景的方法。针对现有方法的缺点和不足，我们通过不断的努力，将各种检测方法有机结合，取长 补短，研发出简单、快速、方便、价廉，且敏感性、特异性很高的HPV检测方法并应用于宫颈癌的筛 查中。

以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术，在目前国内的临床诊断中应用最为广泛。在采用探 针法的实时荧光PCR反应体系中，根据所检测病原体的种类，还可以分为单重或多重实时荧光PCR 技术，反应体系中往往包括一对或多对特异性PCR引物及探针，通过研发过程中的条件摸索，探针及 引物只与相对应的模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团 (Reporter,R)，如FAM、VIC、ROX等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如BHQ1、BHQ2、 TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随 着PCR的进行，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就 会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。采用实时荧光PCR技术检测HPV 各亚型的关键是需要设计出能够特异、灵敏的检测出各亚型的PCR引物及探针。

目前市场上有两类HPV诊断试剂盒,一类是用PCR荧光法和单一荧光染料生产HPV诊断试剂盒， 由于产品中所有的探针分子都使用相同的荧光染料，这种产品不能分辨出HPV亚型类别，也无法检测 出HPV不同亚型的量。另一类产品是用杂交蒱捉或基因芯片法生产的，这种产品能分辨出各种不同的HPV亚型类别，但不能检测出它们的量。此外基因芯片法的试剂盒，操作复杂、测试时间长、成本高、 不易推广。