[发明专利]增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用

权利要求书

1.一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)构建增强型绿色荧光蛋白标记的表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP；

(b)制备玉米丝黑穗菌原生质体；

(c)利用原生质体遗传转化法，将表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP转入玉米丝黑穗菌内；

(d)对标记增强型绿色荧光蛋白的玉米丝黑穗菌株进行检测和筛选；

(e)获得增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株；

其中：表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP是由启动子mig2－5－1与EGFP连接构建；

mig2－5－1启动子片段序列为：

AACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGTGGAGCGTTCCAACCCACACCTTGAGGTCGAGATCCAGTAGCCACATATTCCACGCATTTCTGGATTCGTTTCCAGTATGTGATCAAGTTGGTGGGCCTTGCAACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGCTCTTGACTCATCACAGCCGTTACTCTGCATTGCTTGCTCTCGAT。

2.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(a)包括：

1)切除含有EGFP的质粒PHD3中的otef启动子，命名为PHD3—H；

2)将mig2－5－1启动子与含有EGFP的PHD3—H连接构建表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP。

3.根据权利要求2所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(a)中用限制性内切酶NcoⅠ与XbaⅠ双酶切质粒PHD3去除otef启动子；mig2－5－1启动子在与PHD3—H连接前用NcoⅠ与XbaⅠ双酶切处理。

4.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述玉米丝黑穗菌为玉米丝黑穗菌株SR1和SR2。

5.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(b)的具体方法为：将玉米丝黑穗菌加入到YEPS培养液内混匀，振荡过夜培养，离心收集沉淀，再用SCS溶液重悬沉淀，用Novozyme溶液重悬沉淀，最后用STC溶液冲洗沉淀物，重悬后即可得到原生质体；其中，Novozyme溶液的用量为25－30mg/ml。

6.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(c)的具体方法为：将构建成功的载体质粒，采用ScaⅠ内切酶切线性化，产物纯化回收；将线性化载体质粒和肝素钠溶液吸打混匀后，加入原生质体并吸打混匀，最后加入STC/PEG混匀，得到混合液；将混合液均匀涂在平板上，放置于28℃培养箱中；选取菌落在PDA平板上均匀划线，放置于28℃培养箱中；其中，载体质粒和肝素钠溶液的重量之比为1：6。

7.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(d)包括：

1)采用PCR方法，检测表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP是否进入玉米丝黑穗菌中；

2)采用倒置荧光显微镜观察增强型绿荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株是否具有荧光表达。

8.根据权利要求7所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，进行PCR验证时，mig2－5－1－EGFP上下游引物序列为：

mig2－5－1－EGFP－F：ATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTG；

mig2－5－1－EGFP－R：TCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAG。

9.根据权利要求1－8任一项中所述的方法制备的增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株。

10.权利要求9所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株在抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面的应用。