[发明专利]三疣梭子蟹血细胞的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.三疣梭子蟹血细胞的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：包含酶标板、封闭液、洗涤液、酶标记抗体、pNPP底物显色液、磷酸盐缓冲液、血细胞抗凝剂和抗三疣梭子蟹血细胞的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹血细胞的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述抗三疣梭子蟹血细胞单克隆抗体是由杂交瘤细胞株3F4分泌的抗三疣梭子蟹血细胞的单克隆隆抗体。

3.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹血细胞的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的封闭液为含2.0％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹血细胞的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液为含0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹血细胞的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的酶标记抗体为碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体。

6.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹血细胞的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的血细胞抗凝剂为含0.02M EDTA的磷酸盐缓冲液。

7.一种三疣梭子蟹血细胞的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)、制备三疣梭子蟹血细胞标准样品：从健康的三疣梭子蟹游泳足基部软膜处抽取血淋巴，离心后、得到的全血细胞沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，制成单细胞悬液，调整细胞悬液浓度为106cells/mL，经超声破碎后，即为血细胞标准样，作为抗原使用；

(2)、制备单抗：以血细胞标准样品为抗原免疫小鼠，Balb/c免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合、克隆，制备三疣梭子蟹血细胞单克隆抗体；用间接免疫荧光法选取1株免疫荧光反应结果为强阳性，且能与颗粒细胞特异性结合的单克隆抗体作为抗三疣梭子蟹血细胞单克隆抗体；

(3)、优化抗原与抗体的最佳使用比例：分别用PBS将上述血细胞标准样品与上述血细胞单克隆抗体稀释不同的浓度梯度，通过ELISA棋盘滴定法获取抗原抗体的最适反应比例，从而确定抗原抗体的最佳使用比例；

(4)、建立检测结果的评估标准：上述的血细胞标准样用考马斯亮蓝测定其蛋白浓度，用PBS稀释血细胞标准样为不同的浓度梯度，及不经稀释的血细胞单克隆抗体3F4作为第一抗体，用ELISA法测定各个稀释度的OD值，来确定试剂盒的最低检测限度。